关键词： 基因转移；免疫耐受；皮肤移植；组织相容性抗原

【摘要】目的通过胸腺内注射质粒PXN（N2-B19-H-2K^b）,表达外源性主要组织相容性抗原复合物（MHC）抗原,以小鼠皮肤移植为模型，诱导移植免疫耐受，为免疫耐受提供理论和实验依据。方法应用逆转录病毒载体介导的基因转移技术，通过BALA/C胸腺内注射质粒PXN（N2-B19-H-2K^b），将外源性MHC基因转移到胸腺细胞，14天后行异基因小鼠皮肤移植。应用聚合酶链反应（PCR），反转录聚合酶链反应（RT-PCR），单克隆抗体免疫荧光染色流式细胞仪检测胸腺细胞DNA，mRNA和MHC蛋白质表达。结果外源性MHC基因已整合到靶细胞染色体DNA并有效地转录，胸腺细胞表面有外源性MHC分子表达，转染效率为5%，胸腺内注射质粒PXN（N2-B19-H-2K^b）能明显延长异基因小鼠的皮肤移植时间，平均27天，对照为10天（P＜0.001）。受体鼠脾细胞对ConA的增殖反应在正常范围。结论供体鼠MHC基因转移至受体鼠胸腺诱导了对供体皮肤移植的免疫耐受。

Expression of allogenic MHC gene in thymus by retroviral-mediated gene transfer induces tolerance

LI Jinhua,CHEN Yongxiong,YU Xueqing,et al.Nephrology Department,First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080

【Abstract】ObjectiveA mice skin graft tolerence model was constructed by intrathymic injection of retroviral vector PXN（N2-B19-H-2K^b） to express exogenous major histocompatibality complex(MHC).It could add theoritical and experitmental data for tolerence.MethodsRetroviral vector PXN（N2-B19-H-2K^b） was injected into BALA/C thymus directly to express MHC of C57BL/6(H-2 b）;and the polymerase chain reaction (PCR) , the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and flow cytometry assays were used to check DNA,mRNA and MHC protein expression in thymocytes.ResultsAllogenic MHC gene has been integrated into the chromosomal DNA of BALA/C thymus and expressed stably ;it induced allogenic mouse skin graft tolerance:27days vs 10 days(P＜0.001).The reaction of splenocytes in tolerance mice to ConA was in normal range.ConclusionAllogenic MHC gene transferring into recepient thymus directly could induce tolerance to allogenic mice.

【Key words】Gene transferImmunological toleranceSkin graftHistocompatibality antigen

最近10年来，虽不断有新的抗排斥药问世，急性排斥率也明显降低，但抗排斥药价格昂贵，缺乏特异性而引起全身免疫功能下降而导致感染，肿瘤高发率等严重阻碍它的进一步应用。因而诱导机体对移植器官产生特异性的免疫耐受而保持正常的免疫功能成为目前研究的热点之一。目前认为，胸腺是T细胞发育成熟的主要部位,成熟T细胞库表现为自己MHC限制性和自己耐受两种特征。T细胞克隆在胸腺内发育过程中如果接触到异基因的MHC抗原，则通过阴性选择机制形成对此异基因的MHC抗原的免疫耐受^［1］。据此，我们通过胸腺内注射质粒PXN（N2- B19-H-2K^b）,表达外源性主要组织相容性抗原复合物(MHC)抗原,以小鼠皮肤移植为模型，诱导移植免疫耐受，为免疫耐受提供理论和实验依据。

材料和方法

一、动物

受体鼠BALB/c（H-2^d）,供体鼠C57BL/6(H-2 b）,第三无关供体鼠CBA/J(H-2^k），皆雄性，6～8周龄，由中山医科大学实验动物部提供。

二、主要试剂、质粒

DOTAP(Boehringer Marmnnheim)； DMEM细胞培养基、抗小鼠CD₃单克隆抗体(GIBcoBRL)；ConA、丝裂霉素（Sigma）;氚标记胸腺嘧啶核苷（³H-TdR）3.7×10⁷ Bq/ml,比度7.4×10¹¹ Bq/mmol（中国原子能科学研究院）。生物素标记抗H-2K^b单克隆抗体（Pharmingen）;荧光素标记亲和素Avidin FITC(SABC)；表达供体鼠（H-2 b）MHC Ⅰ类抗原的逆转录病毒载体PXN(N2-B19-H-2K^b）质粒由美国国立卫生研究院Sandra Doren博士惠赠。

三、胸腺注射方法

麻醉BALB/c（H-2^d）小鼠，仰卧位固定四肢及头部，在胸骨上窝正中切开皮肤，钝性分离至气管并沿气管向前直至暴露胸腺上极，每只小鼠注射DOTAP 2 μg+ DMEM 2 μl + PXN(N2-B19-H-2K^b）1.2 μg或DOTAP 2 μg+ DMEM 2 μl，缝合皮肤。

四、外源性MHC基因表达的检测

胸腺注射后28天，（1）按文献［2］提取DNA。以一对引物［逆转录病毒载体PXN（N2-B19-H-2K^b）图及引物A,B,C位置见文献［3］］:引物B: 5'- GCT CTT TCT TTC TGG CTG CT -3'，引物C: 5'-GCC AGA GAT CAC C TG AAT AGT GTG -3'，检测目的基因在小鼠胸腺细胞的整合。PCR:变性93℃×1 分钟, 退火50℃×1 分钟,扩展 72℃×2 分钟 ,35循环,最后扩展 72 ℃×5分钟，产物409bp；（2）按文献［2］提取总RNA,反转录后以一对引物作PCR,引物A: 5'- TAT ATA GCA CGG CAC TGC CG-3'，C同上。产物 431 bp，以一对引物(sense： 5'- CCT GGT CTT TCT GGT GCT TG -3',anti-sense: 5'-GCA TCA TGA TGC TTG ATC AC -3')扩增小鼠β₂微球蛋白基因的mRNA为阳性内参照，反转录后PCR方法同上，产物360 bp；（3）取胸腺注射PXN(N2-B19-H-2K^b）的小鼠胸腺细胞，以胸腺注射DOTAP + DMEM 的小鼠胸腺细胞为零管，用抗H-2K^b单克隆抗体直接免疫荧光法染色，流式细胞仪检测目的基因在转染小鼠胸腺细胞上的表达。

五、实验动物分组和小鼠皮肤移植模型的建立

(1)供体鼠：将40只C57BL/6 小鼠随机分为4组：对照1组和对照2组胸腺注射DOTAP 2 μg加 DMEM 2 μl；第3组胸腺注射PXN(N2-B19-H-2K b)1.2 μg加DOTAP 2 μg 和DMEM 2 μl；第4组静脉注射PXN(N2-B19-H-2K b)1.2 μg加DOTAP 2 μg 和DMEM 2 μl；第5组为第三供体组(CBA/6小鼠,10只)。(2)受体鼠：皆BALB/C小鼠，50只随机分为5组。胸腺注射或静脉注射的当天及第3天，除对照1组外，各组小鼠给予腹腔注射anti-CD₃ monoclonal Ab 8.4 μg/mice，14天后按文献［4］行小鼠皮肤移植。(3)皮片排斥时间的确定：90%以上皮片坏死、脱落。结果用皮片平均存活时间表示(MST)。

六、小鼠脾细胞对丝裂原增殖反应的观察^［5］

各组小鼠胸腺注射或静脉注射后第三周分离脾细胞，96孔板每孔加5×10⁵细胞,设3个复孔,加入5.0 μg/ml(终浓度)ConA.用³H-TdR掺入法作脾细胞对丝裂原ConA的增值反应。常规收集细胞,测样本³H-TdR掺入率,以cpm±s 表示。

七、小鼠混合淋巴细胞反应^［6］

用³H-TdR掺入法分别作对供体或第三供体的单向混合淋巴细胞反应（MLR）。各组小鼠胸腺注射或静脉注射后第三周分离脾细胞，调细胞浓度为5×10⁶/ml,作为MLR中的反应细胞,按5×10⁵/孔加入96孔板, 设3复孔;另取丝裂霉素处理的C57BL/6或CBA/6小鼠脾细胞作为刺激细胞(5×10⁵/孔)，混合培养56小时后,加入用³ H-TdR(1.85×10⁷Bq/孔)，继续培养10小时,常规收集细胞,测样本³H-TdR掺入率,以cpm±s 表示。

八、实验数据统计处理

实验结果以±s表示。用多因素方差分析（ANOVA），继以最小显著差异法（LSD法），比较组间差异。

结果

一、外源性MHC基因表达的检测

1.胸腺注射的小鼠28 天后提取胸腺细胞DNA作PCR,扩增产物在1.5%琼脂糖电泳分析显示转染PXN(N2-B19-H-2K^b)载体的有特异扩增的H-2K^b cDNA(409 bp)的片段，而注射DOTAP+DMEM的胸腺细胞则没有(图1)。

图1PCR检测小鼠细胞异MHC基因

Lane 1:PCR marker;Lane 2:PCR检测小鼠胸腺细胞DNA(胸腺内未注射PXN(N2-B19-H-2K^b)；Lane 3:PCR检测小鼠胸腺细胞DNA(胸腺内注射PXN(N2-B19-H-2K^b)

2.胸腺注射的小鼠28 天后提取胸腺细胞RNA作PT-PCR,扩增产物在1.5%琼脂糖电泳分析显示转染PXN(N2-B19-H-2K^b)载体的有特异性扩增

H-2K^b mRNA反转录的cDNA的片段(431 bp)，而注射DOTAP +DMEM的胸腺细胞则没有。内参照为小鼠β₂微球