关键词： 载脂蛋白E；糖尿病肾病；基因频率；多态性

【摘要】目的研究糖尿病肾病(DN)发生、发展的遗传学倾向，寻找与DN发病有关的基因。方法采用PCR-RELP技术，研究了97例Ⅱ型糖尿病(DM)患者Apo E基因多态性与DN及其脂代谢异常的关系。结果(1)DN组ε2等位基因频率明显高于糖尿病组(P＜0.01)及正常组(P＜0.005)；在尿白蛋白排泄率＞200μg/min组和20～200μg/min组之间Apo E基因频率无明显差异。(2)携ε2等位基因的DM患者甘油三酯(TG)水平明显高于携ε3组(P＜0.05)，而胆固醇Chol(P＜0.001)，低密度脂蛋白(LDL)(P＜0.01)则明显低于携ε3组；同时ε2组出现蛋白尿的比率及在DN时发生脂代谢异常的比率均增加，但无统计学意义。(3)携ε3的DM组Apo A水平比ε2，ε4组均明显升高(P＜0.05)。(4)在全部DM患者中ε2等位基因频率女性高于男性(P＜0.025)，但在DN患者中携ε2等位基因频率无性别差异。(5)Apo ε2等位基因含量与DN发生率有关，ε2纯合子发生DN的比率较非ε2携带者明显增加(P＜0.05)。结论Apo E基因多态性与DN发生有关，ε2等位基因频率越高，发生DN的可能性越大，并且DN发生与E2含量有关，在DM的E2/2纯合子中100%发生DN；ε2频率与脂代谢异常有关，并且ε2能加重DN时的脂代谢异常；Apo E与Apo A可能有一定相关关系；在DM患者中Apo E多态性有性别差异；Apo E2等位基因频率与DN诊断之间具有一致性，以Apo E2/2作为DN诊断的一个辅助指标，在临床上有一定应用价值。

Study on apolipoprotein E polymorphism in type Ⅱ diabetes mellitus patients with nephropathy

ZHANG Xuetao,ZOU Dajin,LI Hui,et al.Department of Endocrinology,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433

【Abstract】ObjectiveIn order to confirm the tendency of heredity in DN,and to find out the related genes.MethodsThe association of Apo E genetic polymorphism,diabetic nephropathy (DN) and lipid abnormalities was investigated in 97 type Ⅱ diabetic(DM) patients with technique of PCR-RFLP.Results(1)Apo E2 allele frequency was significantly higher in DN patients than in DM patients with normoalbuminuria(P＜0.01)，and than in health subjects(P＜0.005).Apo E genetic freqency was not significantly different between the group of albuminuia＞200 μg/min and the group of albuminuia 20～200 μg/min. (2)DM patients with ε2 had significantly higher level of plasma trigyceride(TG),and significantly lower levels of plasma total cholesterol(Tchol),low density lipoprotein(LDL)compared with that with ε3;(3)Apo A level was significantly higher in DM patients with ε3 than those with ε2 and ε4(P＜0.05)；(4)In all DM patients ε2 allele frequency is higher in women than in man(P＜0.025)，but in DN patients Apo E allele frgquency was not different between men and women.(5)The concentration of Apo E2 allele gene was associated with incidence of DN,the incidence of DN in DM patients with E2/2 was significantly increased compared with that without ε2(P＜0.05).ConclusionApoE genetic polymorphism is associated with diabetic nephropathy.The higher allele frequency is,the more possibly DN happens.Onset of DN is connected with the concentration of E2,DM patients with E2/2 all suffer from DN;ε2 allele frequency is associated with the lipids abnormality,and ε2 may aggravated lipid abnormalities in DN patient.Apo E may be interrelated with Apo A.In addition,Apo E genetic polymorphism is also perhaps different between men and women in DM.Apo E2 may be used clinically as an assistant diagnostic index.

【Key words】Apolipoprotein EDiabetic nephropathyAllele frequencyPolymorphism

糖尿病是一种复杂的多基因、多因素的异质性疾病。普遍认为糖尿病并发糖尿病肾病(DN)的机制可能有代谢紊乱、血流动力学异常、遗传因素等，但对DN的遗传因素的研究结论不尽相同。目前观察到许多基因的异常与DN发病有关，如血管紧张素转化酶基因、Ⅳ型胶原基因、醛糖还原酶基因等。自1975年Uterman等发现载脂蛋白E(Apo E)具多态性以来，人们已发现Apo E多态性不仅与冠心病、Alzheimer's病等密切相关，而且与DN发生有关。我们采用PCR基因扩增技术，对Apo E基因多态性及等位基因频率与中国Ⅱ型DM患者DN发病的关系进行研究，并探讨其与脂代谢的关系，以期确证DN发病的遗传倾向，寻找与DN发病有关的基因。

材料与方法

一、研究对象

1.糖尿病组：1994～1997年从长海医院内分泌科病房及门诊随机选择Ⅱ型DM患者97例，其中男48例，女49例，年龄33～82岁，平均年龄(60.5±9.27)岁。糖尿病诊断按照WHO标准，糖尿病肾病诊断按尿微量白蛋白排泄率＞20 μg/min列入DN组：＜20 μg/min列入糖尿病无肾病组，简称为DM组。

2.正常对照组(N)：从长海医院等单位健康人群体检中随机选择去除DM、冠心病、Alzheimer病的智力正常者，共121例，其中男61例，女60例，年龄37～102岁，平均年龄(69.5±17.2)岁。

二、研究方法

1.临床及生化检查：(1)测量研究对象的血压、身高及体重：计算体重指数(BMI)＝体重(kg)/身高(m²)。(2)血糖、血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)和血脂测定：抽空腹静脉血，血糖、Cr、BUN用自动生化分析仪，血脂用酶法测定。(3)尿微量白蛋白(Ualb)测定：用放射免疫法。

2.Apo E基因型检测：(1)引物设计(上海细胞生物学研究所合成)。引物1：5’-TCC AAG GAG CTG CAG GCG GCG CA-3’；引物2：5’-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC ACT GCC A-3’。(2)DNA抽提：全部研究对象均于禁食12小时后，次晨采前臂静脉抗凝血10 ml，用盐析法抽提DNA，TE(Tris-EDTA)溶解，调整DNA模板浓度至工作浓度1 μg/μl。(3)扩增：PCR反应体系：总体积25 μl,模板DNA 1 μl,引物各1 μl，dNTP 0.4 μl,MgCl₂ 1.5μl，10×buffer 2.5μl，甲酰胺2.5μl，94℃预变性5分钟再加TaqDNA聚合酶(Promega公司)1 μl，PCR扩增仪扩增。变性94 ℃30秒，退火65 ℃ 30秒，延伸70℃ 1分钟，共35个循环，最后进一步延伸70 ℃ 5分钟。(4)纯化：PCR产物进一步纯化，按试剂盒(宝灵曼公司)说明书操作，溶于20 μl蒸馏水中。(5)酶切：15 μl体系：双蒸水7.5 μl;酶切buffer B 1.5 μl；Cfo Ⅰ酶(Promega公司)1 μl；PCR纯化产物5 μl。在冰浴中完成加样后离心，置37 ℃水浴酶切12小时，取出后在65水浴中加热5分钟，立即-20 ℃保存。(6)电泳：取酶切产物15 μl进行质量分数为12%聚丙烯酰胺(Sigma公司)凝胶电泳，水平电泳槽100V电泳约90分钟，溴化乙锭染色，于紫外灯下观察结果并摄片。

三、统计方法Apo E基因型频率数据用计数法获得(基因频率＝基因型频数×2)，实验数据采用t检验和χ²检验。

结果

一、采用限制性片段长度多态性(RFLP)方法检出Apo E常见的基因型

见图1。Apo E基因的6种基因型的PCR扩增产物Cfo Ⅰ内切片段电泳模式图见图2。

图1PCR产物酶切电泳结果

图2Apo E基因的6种基因型的PCR扩增产物Cfo Ⅰ片段电泳模式图

二、97例DM患者的临床及生化特征

DM组及DN组之间除尿微量白蛋白(中位数分别为5.93 mg/L和43.46 mg/L)外其他临床及生化指标均无明显差别。

三、DM、DN及正常组ApoE基因型及等位基因频率的比较

见表1、2。DN组ε2等位基因频率明显高于正常组(P＜0.005)和DM组(P＜0.01)。

四、尿蛋白与Apo E及临床指标关系

在白蛋白尿20～200 μg/min和＞200 μg/min组之间Apo E等位基因频率无明显差异。但＞200 μg/min组BUN［(8.56±5.42)mmol/L］明显高于20～200 μg/min组［(5.79±2.38)mmol/L］(P＜0.05)，其它临床指标无明显差异。

五、Apo E等位基因与所有DM患者的临床参数的关系(ε2包括E2/2，E2/3，E2/4；ε3包括E3/3；ε4包括E3/4，E4/4)

见表3。ε2组TG明显高于ε3组，Chol及LDL则明显低于ε3组，ε2组尿微量白蛋白、DN发生比率及血Cr均有增加趋势，但无统计学意义。ε3组Apo A明显高于ε2组及ε4组(P＜0.05)。

六、Apo E基因多态性与性别的关系

见