设为首页
加入收藏
求医中医药网
www.qe.cn
站内搜索
【摘要】目的探讨阻断肾素-血管紧张素系统(RAS)对糖尿病大鼠肾组织转化生长因子β受体(TβR)表达的影响。方法大鼠随机分为单侧肾切除组(C组)、糖尿病组(D组)和糖尿病苯那普利(10 mg·kg-1.d-1，灌胃)治疗组(DB组)。观察4周后分别用半定量RT-PCR和Western杂交检测各组肾皮质TβRⅠ和TβRⅡ mRNA和蛋白表达。另外，各组血浆、肾皮质、肾髓质ACE活性由荧光分光光度法测得。结果糖尿病组四周即出现明显相对肾重增加和血肌酐水平上升(P＜0.05)，尽管血浆ACE活性有所下降，肾皮质ACE活性却明显增加(P＜0.05)。糖尿病组肾皮质TβRⅠ和TβRⅡ mRNA和蛋白表达分别比对照组增加1.12、3.00倍和1.10、2.62倍；苯那普利治疗四周能明显缓解糖尿病相对肾重增加和血肌酐水平的上升(P＜0.05)，对血浆、肾皮质、肾髓质ACE活性抑制分别达92.00%、88.77%、73.40%(P＜0.01)，对肾皮质TβRⅠ和TβRⅡ的mRNA和蛋白表达抑制分别达63.89%、44.44%和52.13%、47.62%。结论应用苯那普利阻断糖尿病大鼠RAS可明显下调肾皮质TβRⅠ和TβRⅡ mRNA和蛋白表达，然而其确切机制尚有待于进一步研究。
Blockade of renin-angiotensin system down-regulate expression of transforming growth factor-β receptor in diabetic rats kidney
WU Yonggui,LIN Shanyan.Division of Nephrology,Huashan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200040
【Abstract】ObjectiveTo investigate regulation of renin angiotensin system(RAS) blockade on expression of transforming growth factor-β receptor(TβR) in diabetic rats kidney.MethodsThe rats were randomly divided by following groups:uninephrectomized(group C)、streptozotocin diabetic rats(group D)and diabetic rats treated with benazepril(10 mg·kg-1.d-1,by gavage,group DB).At 4 week's duration of study,mRNA and protein expressions of TβRI and TβRⅡ were measured by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)and Western blot analysis,respectively.In addition,angiotensin coverting enzyme(ACE)activities were determined by the fluorimetric assay in plasma,renal cortex and renal medulla.ResultsAfter 4 weeks,diabetic rats developed increased relative kidney weight and serum creatinine level as well as ACE activities in renal cortex despite a decreased ACE activities in plasma.RT-PCR and Western blot analysis demonstrated that mRNA and protein expressions of TβRⅠand TβRⅡ were increased by 1.12，3.00 and 1.10，2.62 folds in renal cortex,respectively;Administration of benazepril might markedly attenuate elevated relative kidney weight and increased serum creatinine level,ACE activities were reduced by about 92.00%，88.77% and 73.40% in plasma,renal cortex and medulla,respectively,mRNA and protein expressions of TβRⅠ and TβRⅡ were diminished by approximately 63.89%，44.44% and 52.13%，47.62%，respectively.ConclusionBlockade of RAS with benazepril could significantly down-regulate mRNA and protein expressions of TβRⅠ and TβRⅡ in diabetic rats kidney.However,its exact mechanism remains to be further determined.
【Key words】DiabetesKidney hypertrophyBenazeprilTransforming growth factor-β receptor
糖尿病肾病(DN)早期的病理特征主要为肾脏血流动力学紊乱和肾脏肥大。近年来认为其发病机制是以高血糖为启动因素所诱导的各种血管活性物质、生长因子、细胞介质、化学趋化因子等综合作用的结果，其中血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)和转化生长因子β(TGF β)所起的作用尤为人们所注意［1］。众多临床和实验研究均证实阻断肾素-血管紧张素系统(RAS)能明显延缓DN进展，目前研究表明其作用机制并不局限在传统的基础上如改善血流动力学紊乱等，更重要是可抑制高血糖状态下多种损失介质的表达或作用。最近，我们和其他学者均在糖尿病模型中证实利用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)阻断RAS可抑制肾组织TGFβ表达［2］，然而，有关高血糖状态下阻断RAS对TGFβ受体的影响仅在体外实验中得到证实。为此，我们在以前的研究基础上进一步从受体的角度进行了探讨。
资料与方法
一、研究设计
20只纯种雄性成年Wistar大鼠(体重180～200 g，由上海计划生育研究所提供)在接受右侧肾切除术后2周随机分为：(1)对照组(C组，n＝6)；(2)糖尿病组(D组，n＝7)；(3)糖尿病+苯那普利组(DB组，n＝7)。糖尿病模型建立采用腹腔一次性注射链脲佐菌素(STZ，Sigma公司，60 mg/kg)方法。苯那普利(北京诺华制药有限公司，10mg·kg-1.d-1)灌胃，C与D组仅给予等量自来水灌服。所有大鼠在整个实验期间均喂标准饮食，也不使用胰岛素。
二、标本收集
观察4周后大鼠在质量分数为3%水合氯醛麻醉下行右侧颈总动脉插管收集血标本，待测血糖、血肌酐水平及血浆ACE活性；肾脏在腹主动脉插管后注入4℃预冷的生理盐水反复灌洗后，称重，分离皮、髓质，保存于-70℃冰箱中待测肾组织ACE活性及总RNA和细胞膜总蛋白提取。血糖和血肌酐水平由日立7150型全自动生化分析仪测得。
三、血浆及肾皮、髓质ACE活性测定
参考Unger等［3］方法略加改进，由日立F-4000型荧光分光光度计测得(Ex360nm、EW486nm)。所需试剂马尿酰-组氨酰-亮氨酸(hippuryl-l-histidy1-L-leucine,Hip-His-Leu)、邻苯二醛(o-phthadialdehyde)及组氨酰-亮氨酸(His-Leu,HL)均购自Sigma公司。
四、半定量RT-PCR
采用异硫氰酸胍一步法提取肾皮质总RNA，由756型紫外分光光度计测定其纯度和含量，并在质量分数为1%甲醛变性凝胶电泳中证实其完整性。取总RNA 2μg按逆转录试剂盒(Promega公司)逆转录成cDNA，TGFβ Ⅰ型受体(Type Ⅰ TGF β receptor TβRI)引物由上海医科大学中山医院肝癌研究所张春东博士惠赠，引物1序列为5’-GGGGC-GACGGCGTTACAGTGTTTCT3’，引物2为5’-CTGGTAGTTGTACTCACTCTACGTCTGCTT3’；TβRⅡ引物参考Tsuchida等［4］由中科院生化所DNA合成仪合成，引物1序列为5’GTTTGAGACCGTGGCTGTCAAGATCT3’；引物2为5’AAGAGGTTTAAGTAGGACCTAAGA3’；GAPDH作为“管家基因”监控RNA上样量，引物1序列为5’AGATCCACAACGGATACATT3’，引物2为5’-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3’。PCR扩增条件为：TβRⅠ94℃预变性2分钟、然后94℃1分钟，57℃1分钟，72℃2分钟，72℃延伸7分钟，共28个循环，扩增产物长度为347bp；TβRⅡ R94℃预变性2分钟、然后94℃1分钟，60℃2分钟，72℃ 3分钟，72℃延伸10分钟，共30个循环，扩增产物长度为503bp；GAPDH扩增条件为94℃预变性2分钟、然后94℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 1分钟，72℃延伸7分钟，共28个循环，扩增产物长度为309bp。最后各PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳，于紫外灯下拍照。为了半定量PCR产物，将胶片上反应条带在IBAS-2000图像分析仪中扫描，TβRⅠ和TβRⅡ mRNA相对含量用TβRⅠ、TβRⅡ与GAPDH吸光度×面积的比值表示。
五、Western杂交分析
参考Tsao等［5］方法在蔗糖缓冲液中提取肾皮质细胞膜总蛋白，按改良Lowry法测定总蛋白浓度，取总蛋白50μg，加等量样本处理液，100℃煮沸4分钟，质量分数为15%十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳后电转移至硝酸纤维膜上，在丽春红染液中染色观察蛋白转移情况并标出蛋白质分子量标准。然后用质量分数为5%脱脂牛奶的TBST封闭，4℃过夜，洗膜后加兔TβRⅠ多克隆抗体(Santa Cruza公司，工作浓度1∶100)和TβRⅡ多克隆抗体(上海医科大学中山医院肝癌研究所张春东博士惠赠，工作浓度1∶100)进行杂交，再度洗膜后加HRP标记的山羊抗兔IgG(华美生物工程公司，工作浓度1∶100)进行二抗杂交。最后，洗膜后加入现配的免疫印迹化学发光试剂(华美生物工程公司)，然后进行放射自显影，所有杂交信号在IBAS-2000图像分析系统进行扫描，结果用吸光度与面积之乘积半定量各组TβRⅠ和TβRⅡ表达。
六、统计学处理
数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析和q检验。
结果
一、各组血糖、血肌酐水平及相对肾重的变化
单侧肾切除后建立的糖尿病大鼠4周后血肌酐水平已明显上升(P＜0.05)，相对肾重即肾脏肥大指数也明显增加(P＜0.05)；苯那普利治疗后对糖尿病大鼠血肌酐水平上升及相对肾重增加均有明显延缓作用(P＜0.05)，见表1。
表1各组血糖、血肌酐水平及相对肾重的变化(
