关键词： 白细胞介素10；系膜细胞；基因转移

【摘要】目的为特异性地将病毒性白细胞介素10(vIL-10)基因转移到肾脏提供一种手段。方法应用逆转录病毒载体介导的基因转移技术将外源性基因vIL-10转移到大鼠肾脏系膜细胞，应用RT-PCR、ELISA方法检测其表达，并通过对混合淋巴细胞反应(MLR)的影响对其活性进行分析。结果vIL-10在转染的系膜细胞表达20 000 pg·(10⁶细胞)^-1/24h，应用³ H-TdR掺入法检测vIL-10对MLR的影响，实验组明显低于对照组(P＜0.05)。结论外源性基因在系膜细胞有效地转录和表达，并对MLR有抑制作用。

Establishment of mesangial cell gene transfer vector expressing interleukin-10

JI Yunian,YANG Yanqiang,CHEN Yongxiong,et al.Department of Nephrology,First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080.

【Abstract】ObjectiveTo provide a method for specificity transfer vIL-10 gene to kidney.MethodsvIL-10 gene was tranferred into rat glomerular mesangial cells by retroviral-mediated gene transfer techniques.The expression of vIL-10 was detected by RT-PCR，ELISA and its bioactivity was determined by mix lymphocyte reaction (MLR).ResultsThe amount of expression of vIL-10 in mesangial cell at least was 20 000 pg·(10⁶ cell)^-1/24h，and the ³ H-thymidine incorporation in MLR was significantly lower than that in control group (P＜0.05).ConclusionvIL-10 gene can be expressed effectively in mesangial vector,and can inhibit the MLR.

【Key words】Interleukin-10Mesangial cellGene transfer

成功的肾脏移植给许多终末期肾病的患者带来了福音，但是，由于供受体主要组织相容性抗原复合物(MHC)的差异，导致免疫排斥。虽然环孢素A(CsA)等药物的应用极大地促进了器官移植的发展，但由于全身性地应用免疫抑制剂易导致机体感染、肿瘤的发生及本身的毒性作用从而严重地影响着移植受者的存活。因此，不少研究者希望能将免疫调节物质特异性地转移到移植物，使其在移植物局部发挥作用，从而将避免全身应用免疫抑制剂的毒副作用。通过建立系膜细胞基因转移载体，将免疫调节物质(如vIL-10)基因转移到移植肾为这种设想提供了实现的可能和希望。利用系膜细胞载体将免疫调节基因特异地转移到肾小球^［1］，使其在局部发挥免疫抑制从而对抗受体的免疫排斥作用，从而避免了全身性应用免疫抑制剂的毒副作用。

为了将vIL-10特异性地转移到肾脏，我们通过逆转录病毒载体介导的基因转移方法将vIL-10基因转移到大鼠系膜细胞(MsC)，建立了携带免疫抑制基因的系膜细胞载体，为进一步探索IL-10在诱导免疫耐受中的作用及应用IL-10进行免疫基因治疗提供了物质基础。

材料与方法

一、材料

含vIL-10cDNA的逆转录病毒重组体pLvSN(构建参见文献［2］)，双嗜性包装细胞PA317(中山医科大学免疫学教研室)，NIH3T3(暨南大学分子医学中心)。总RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒及PCR试剂盒(Promega)。脂质体(lipofectin AMINE),DMEM/F12培养基，胎牛血清及G418(Gibco BRL)。RT-PCR引物5’→3’ATGGAGCGAAGGTTAGTGTC，3’→5’ACTCTTGTTCTCACGGCAG(上海细胞生物学研究所合成)。polybrene(Sigma)。vIL-10单克隆抗体JES3-9D7，JES3-B11(Pharminge)。³ H-TdR(中国原子能研究所)。近交系小鼠BALB/C、CH57L/6，近交系Lewis大鼠(中山医科大学实验动物部)。

二、方法

(一)包装细胞系的传染：

1.包装细胞PA317的转染与克隆筛选：用脂质体法转染包装细胞PA317，按脂质体试剂盒说明书方法进行。

2.测定逆转录病毒载体效价：经反复3代感染的抗G418的PA317阳性克隆以1×10⁵接种于100 mm²的培养皿，以不含G418的完全培养基培养24小时后换以新鲜培养基收集上清。取每个克隆的培养上清1ml(含病毒颗粒)，分别以10³，10⁴，10⁵的倍数作系列稀释，取上述系列稀释的培养液上清1ml，加入到1×10⁵NIH3T3的6 cm²的培养皿中，同时加入polybrene使其终浓度为6 mg/L,37℃孵育3小时后加入G418(500 mg/L)选择培养基培养2周，计数G418抗性克隆，病毒滴度＝克隆数×稀释倍数×10(CFU/ml)。

(二)大鼠肾系膜细胞转染：

1.大鼠肾系膜细胞的培养和鉴定：按文献［3］方法，无菌条件下取6～8周Lewis大鼠肾皮质，置80目网筛上研磨，收集网下肾小球，置200目筛网上用Hank液冲洗并收集肾小球，以质量分数为15%的新生牛血清(NBS)-DMEM/F12培养液悬浮肾小球，置37℃体积分数为5% CO₂孵箱培养，待瓶长满后用质量分数为0.25%胰蛋白酶加质量分数为0.02%EDTA消化传代。

2.大鼠肾系膜细胞的转染：经传4代的系膜细胞以5×10⁵细胞传至6孔培养板，加入无G418培养的PApLvSN培养24小时的上清1ml，加入polybrene使其终浓度为6 mg/L，48小时后换为含G418(800 mg/L)培养基筛选培养。

(三)vIL-10在系膜细胞表达的检测：

1.RT-PCR检测vIL-10mRNA的表达：用RNA提取试剂盒异硫氰酸胍一步法提取系膜细胞总RNA。随机引物法逆转录为cDNA，以vIL-10特异性引物进行扩增。97℃变性5分钟；96℃60s，60℃ 90s，72℃ C120s，30个循环。取5 μl PCR产物在质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳，检测vIL-10 mRNA在MsC的表达。

2.ELISA检测vIL-10的表达：取经G418筛选的系膜细胞(1×10⁶)培养24小时上清，按ELISA试剂盒操作说明进行，其中JES3-9D7作为包被抗体，JES3-B11作为检测抗体。

3.vIL-10生物活性分析：即用vIL-10对体外淋巴细胞混合培养(MLC)的抑制效应。取近交系小鼠BABL/C和CH57BL/6的脾细胞应用淋巴细胞分离液分别制成单个核细胞悬液。以BABL/C脾细胞作为刺激细胞，CH57BL/6脾细胞作为效应细胞。脾细胞经密度梯度离心，PBS洗涤2次，Tris-NH₄Cl溶解RBC，RPMI 1640培养基+质量分数为10% FCS以5×10⁵的效应细胞及经40 g/L丝裂霉素处理的刺激细胞混合培养，实验组每孔加入不同比例稀释的pLvSN转染的MsC的上清，对照组每孔加入相同比例稀释的空载体pLXSN转染的MsC上清。96孔板37℃体积分数为5%的CO₂培养箱培养6天。所有实验均设4个复孔重复3次，应用³ H-TdR法检测淋巴细胞的增殖状态，在最后培养结束前6小时每孔加入1μCi的³ H-TdR，收集细胞，以β液闪仪测定cpm以了解效应淋巴细胞的增殖情况。

结果

一、逆转录病毒载体转染包装细胞PA317和假病毒颗粒滴度测定

1.用lipofectin AMINE将pLXSNvIL-10重组质粒导入对数增长期的双嗜性包装细胞PA317，在G418(300 mg/L)选择培养3～4天后部分细胞开始死亡，7天后大量PA317细胞被杀死，仅见散在的单个抗性G418细胞，2～3周后单个细胞逐渐形成克隆。

2.G418抗性克隆在高浓度G418选择培养基中扩增筛选，使那些没有获得重组表达质粒的包装细胞，或只是短暂表达外源性基因的包装细胞在高浓度的G418培养基中被杀死，从而获得转入了重组质粒并持续表达包装的细胞，因这些细胞获得neo^R(G418抗性基因)而能在高浓度的G418培养基中生长。为增加假病毒滴度，在第一代产假病毒的PA317细胞经筛选培养扩增后，换为不含G418的培养基的培养上清感染新的PA317细胞，获得第二代产假病毒的包装细胞系，同样方法获得第三代产假病毒的包装细胞系。

3.收集反复三代感染的PA317细胞上清感染NIH3T3细胞，以含G418的培养基选择培养2周后根据G418抗性克隆形成数计算病毒滴度为1×10⁷。

二、vIL-10在系膜细胞表达的分析

1.RT-PCR产物电泳分析：以vIL-10特异性引物进行扩增，未经感染的MsC作为阴性对照，PCR产物在质量分数为1.0%琼脂糖凝胶(1×TAE)电泳，结果感染外源性基因的MsC细胞扩增出特异性387bp的片断，而未感染的MsC则未扩增出相应的片段，说明vIL-10mRNA在转染的MsC的表达。

2.ELISA检测系膜细胞产生vIL-10：重组假病毒上清感染的系膜细胞，经培养24小时的上清vIL-10的表达＞20 000 pg/10⁶细胞，而空载体感染的系膜细胞及对照系膜细胞均未检测到vIL-10的表达。

3.vIL-10对MLR的影响：含vIL-10的转化的系膜细胞的培养上清对MLR的影响(³ H-TdR法)，在MsC/pvIL-10组随着培养上清vIL-10浓度的增加，出现对MLR明显的抑制作用，而对照组MsC/pLXSN却对MLR无影响，P＜0.05。通过vIL-10对MLR的抑制效应初步证实了vIL-10抑制免疫应答的生物学作用。

讨论

器官移植面临