关键词： 间皮细胞；粘附分子；腹腔巨噬细胞

目的通过研究细菌毒素和炎症细胞因子诱导的间皮细胞(MCs)粘附分子表达及其对腹腔巨噬细胞功能的影响，探讨间皮细胞在腹膜抗菌防御中的作用。方法将体外培养的人腹膜间皮细胞以细菌脂多糖(LPS)、TNF-α或IL-1β刺激，采用间接免疫荧光染色技术，于激光扫描共聚焦显微镜下观察间皮细胞表面粘附分子(ICAM-1)的表达；采用细胞瑞氏染色方法，在普通光镜下计数腹腔巨噬细胞的粘附率。结果人腹膜间皮细胞表达ICAM-1，用LPS、TNF-α或IL-1β刺激间皮细胞后培养6小时，ICAM-1的表达高于对照组，有显著性差异(P＜0.05)；各刺激组腹腔巨噬细胞的粘附率也明显高于对照组(P＜0.05)。间皮细胞粘附分子的表达与腹腔巨噬细胞的粘附率呈正相关(r＝0.918)。结论炎症介质和促炎症细胞因子通过刺激腹膜间皮细胞粘附分子表达增加，增强腹腔巨噬细胞的粘附和吞噬，在腹膜抗菌防御中起重要作用。

Effect of adhesion molecular expression of the mesothelial cells on the function of peritoneal macrophageZang Yan,Liu Zhiqiang,Zhang Xun,et al.Dept.of Nephrology,Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515

ObjectiveTo study the role of the adhesion molecule expressed by the mesothelial cells(MCs)in peritoneal antibacterial defence.MethodsThe MCs from human omentum were seperated and cultured in vitro.The adhesion molecule expressed on the surface of MCs and adherence rate of macrophages to MCs incubated in RPMI 1640 medium alone and stimulated by IL-1β、TNF-α or LPS were assaied.ResultsMCs incubated in RPMI 1640 medium alone released trace ICAM-1 as measured by indirect immunofluorescence,and the ICAM-1 level and adherence rate of macrophage were increased significantly when MCs was stimulated by IL-1β、TNF-α or LPS.ConclusionThe MCs takes part in peritoneal antibacterial defence actively by expressing high level of ICAM-1 and increasing adherence of macrophages in the peritoneal inflammation.

Key wordsMesothelial cellsAdhesion moleculePeritoneal macrophage

细菌性腹膜炎是腹膜透析过程中常见的并发症。在腹膜炎症时，腹腔巨噬细胞发挥重要的抗菌防御作用已是公认，而腹膜作为直接与细菌接触的表面，其主要细胞群体—间皮细胞通过分泌多种炎症介质和促炎症细胞因子(如：前列腺素、IL-1、TNF-α等)参与腹膜的抗菌防御反应也已得到证实^［1，2］。可见，细胞在腹膜炎症反应过程中起重要作用。然而，近年研究发现，除细胞外还有一类分子，即介导细胞间粘附作用的膜表面粘附分子，在机体的多种生理、病理过程，特别是在炎症反应过程中也起重要作用^［3］。为此，我们以体外培养的人腹膜间皮细胞和J774腹腔巨噬细胞为靶细胞，研究了炎症介质和促炎症细胞因子诱导的腹膜间皮细胞粘附分子表达对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响，以探讨间皮细胞在腹膜抗菌防御中的作用。

材料和方法

一、人腹膜间皮细胞的分离培养和鉴定按照文献［4］方法。即：无菌取5例人腹膜(肾移植供者)，摘除血管及脂肪组织，用Hank液洗数次，剪碎，用胰蛋白酶/EDTA消化30分钟，37℃不断震摇，终止消化后过200目筛网，1000r/min离心10分钟，弃上清，用含5mg/L转铁蛋白、1mg/L氢化可的松、2mmol/L L-谷胺酰氨和10%FCS的完全RPMI 1640培养液重悬细胞，调整细胞数为1×10⁵/ml浓度，接种在包被明胶的培养瓶中，37℃、5%CO₂培养箱中培养。传代细胞经形态学和超微结构鉴定具有间皮细胞特征。免疫组化示抗细胞角蛋白、抗波形蛋白(vimentin)抗体(购自Dako公司)染色阳性，抗第Ⅷ因子相关抗原(购自Dako公司)和抗白细胞CD45抗原的抗体(购自军事医学科学院)染色阴性。

二、间皮细胞表面粘附分子的诱生及检测取上述5例第三代间皮细胞1×10⁶/ml浓度分别接种于改良的Petri培养皿中，置37℃、5%CO₂培养箱中过夜。设四个组，两个皿为一组，次日于每组培养上清中加入LPS(Sigma产品)、TNF-α或IL-1(购自军事医学科学院)刺激培养，第四组是对照组，为10%FCS的RPMI 1640培养(不加任何刺激因素)；另设一个阴性参照皿(用IL-1刺激，但不染“一抗”)。刺激剂量分别LPS组终浓度为5μg/ml、TNF-α为100U/ml、IL-1组为5U/ml，刺激培养时间为6小时。培养结束后，用PBS洗培养皿3次，弃净液体后加1%多聚甲醛固定细胞5分钟，再用PBS洗3次，吸干皿孔内液体，于每组的第一个Petri培养皿内加入100μl抗ICAM-1抗体(CD54单克隆抗体，美国NeoMarkers公司产品)，第二个Petri培养皿内加入100μl抗VCAM-1抗体(CD106单克隆抗体，法国Immunotech公司产品)，阴性参照皿加含1%BSA的PBS，室温放置45分钟，然后用PBS洗掉未结合的“一抗”，同法于每皿孔内加入100μl适当稀释的羊抗鼠荧光抗体(法国Immunotech公司产品)，室温避光放置30分钟，用PBS洗净未结合的“二抗”。样本经上述步骤标记好后，在激光扫描共聚焦显微镜下(ACAS 570型，美国)进行荧光强度测定。选择紫外波长为488nm，每例样本测定100个以上细胞，以平均荧光值(AV)为定量参数。

三、巨噬细胞-间皮细胞联合培养和粘附率的测定将传代的间皮细胞以1×10⁵/ml浓度接种在Petri培养皿中过夜，待细胞充分伸展变形后，同上述方法加入不同剂量的刺激因子作为实验组，并设一对照组(为10%RPMI 1640培养)，继续培养6小时，培养结束后吸去皿中原培养液，用37℃D-Hank液轻洗2～3遍，将J774细胞(腹腔巨噬细胞株，由本校组胚教研室惠赠)用含10%FCS的RPMI 1640培养液吹打成细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁵/ml，以每皿100μl加入铺满间皮细胞的培养皿中，37℃、5%CO₂培养箱中培养6小时。培养结束后，用37℃PBS洗三次，以去掉非粘附的巨噬细胞，采用倒置显微镜和光镜，根据细胞形态及瑞氏染色方法计数细胞，每皿计数200个间皮细胞，同时计数其表面粘附的巨噬细胞数。根据下列公式计算出巨噬细胞的粘附率，每组共计数5例，并进行统计学处理。

巨噬细胞粘附率＝(间皮细胞上粘附的巨噬细胞数)/(计数的间皮细胞数)×100%

四、数据处理全部数据经统计学处理，以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析、配对t检验，P＜0.05为有统计学差异。

结果

一、间皮细胞表面粘附分子的表达在正常培养条件下培养的间皮细胞表面即可表达少量的粘附分子ICAM-1，不同因素刺激间皮细胞后，其表面粘附分子ICAM-1的表达均明显增高，每组各5例测得平均荧光值从高到低依次为IL-1、TNF和LPS，与对照组比较均有显著性差异(P＜0.05或0.01)，见附图；但三种不同刺激因素组之间比较，其平均荧光值无显著性差异(P＞0.05)。

附图不同因素刺激间皮细胞ICAM-1表达

正常培养条件下培养的间皮细胞及上述因素刺激的间皮细胞均未发现有VCAM-1粘附分子的表达。

二、巨噬细胞的粘附率显微镜下计数联合培养各组巨噬细胞-间皮细胞粘附率分别为：LPS组70.75±6.53%，TNF组73.35±6.68%，IL-1组78.20±7.16%，对照组35.38±6.25%。实验组与对照组经方差分析，进行q检验比较，均得P＜0.01，表明在IL-1、TNF和LPS刺激作用下，巨噬细胞-间皮细胞粘附率较对照组显著增高；但各实验组之间俩俩进行比较，均得P＞0.05，无显著差异。

讨论

腹膜炎症时，腹腔中的巨噬细胞通过吞噬和杀灭侵入腹腔中的细菌发挥重要的抗菌防御作用已是公认。然而，由于CAPD患者的腹腔巨噬细胞受腹膜透析液中各种非生理因素的影响，其功能明显降低^［5］。有试验证实，CAPD患者腹腔中悬浮的巨噬细胞对细菌的吞噬和杀灭能力明显低于粘附于腹膜表面的巨噬细胞^［6］。这表明，腹膜为巨噬细胞提供了一个粘附和促进吞噬的表面，这在CAPD患者的腹膜抗菌防御中起重要作用。

腹膜主要由间皮细胞构成，并形成腹腔的内表面，细菌侵入腹腔粘附在腹膜表面通常是细菌移生和诱发腹膜感染的始动环节。近年研究证实，作为构成腹膜主要细胞群体的间皮细胞，在腹膜炎症时通过分泌多种炎症介质和促炎症细胞因子主动参与腹膜的炎症反应过程，在腹膜的抗菌防御中起重要作用^［1，2］。由于间皮细胞是细菌直接侵袭的腹膜表面主要细胞群体，其又位于腹腔和腹膜微血管之间相互联系的要害部位^［7］，其对炎症细胞，特别是腹腔巨噬细胞功能的影响可能在腹膜抗菌防御中起重要作用，但关于此方面的研究目前尚未见报道。

我们的体外细胞模型研究结果显示，在正常培养条件下间皮细胞即能产生微量细胞粘附分子ICAM-1，当有炎症介质LPS和炎症细胞因子IL-1、TNF-α刺激时，间