关键词： 晚期糖基化终产物受体；β₂微球蛋白；成纤维细胞；透析相关性淀粉样变

目的探讨被晚期糖基化终产物修饰的β₂微球蛋白(AGEs-β₂M)与人类成纤维细胞的相互关系。方法用去垢剂提取人成纤维细胞系(HSFs)膜成份。用免疫印迹法和免疫荧光法鉴定细胞AGE受体(RAGE)。用放射性配体结合法观察AGE-β₂M与HSFs的相互关系。结果HSFs膜表面表达RAGE。AGE-β₂M能以特异、剂量依赖的方式与HSFs结合［亲和常数(Kd)≈86.5 nmol/L］，这一过程可被抗RAGE抗体所抑制，提示该结合是由RAGE所介导。结论成纤维细胞及其相关的间质细胞可能是AGE-β₂M病理生物学效应的靶细胞，从而可能参与了透析相关性淀粉样变(DRA)的发生。

The receptor for advanced glycation end products (RAGE) mediates the binding of AGE-β₂ microglobulin with human fibroblastsHou Fanfan, Zhang Xun, Liu Zhiqiang. Department of Nephrology, Nanfang Hospital, Guangzhou 510515

ObjectiveAn important component of amyloid fibrils in dialysis-related amyloidosis (DRA) is a form of β₂-microglobulin modified with advanced glycation end products (AGEs) of the Maillard reaction, known as AGE-β₂M. The aim of the study is to investigate the interaction between AGE-β₂M and human fibroblasts.Methods Using polyclonal antibody to the receptor for AGEs(RAGE), the immunoreactive material on Western blots of detergent extracts from a human fibroblast cell line (HSF, GM05757A), and on surface of HSFs by immunofluorescence studies were detected. Binding assays were performed using the radiolabeled AGE-β₂.Results RAGE was indentified on the surface of HSFs. ¹²⁵Ⅰ-AGE-β₂M bound to HSFs in a specifi0.c, dose-dependent manner (Kd≈86.5 nmol/L), a process inhibited in the presence of anti-RAGE IgG.ConclusionHuman fibroblasts and related mesenchymal cells may be targets for the pathobiological action of AGE-β₂M, and might be involved in the pathogenesis of DRA.

Key wordsReceptor for advanced glycation end productsβ₂ Microglobulin FibroblastDialysis-related amyloidosis

蛋白质的氨基组经非酶性糖基化反应(Maillard反应)被晚期糖基化终产物(AGEs)所修饰是透析相关性淀粉样变(DRA)、糖尿病慢性并发症及某些老年疾病发生过程中的重要致病环节^［1］。被AGE修饰的蛋白质具有病理生理学活性。已证实，DRA淀粉样沉积物中的主要成份是被AGEs修饰的β₂微球蛋白(AGE-β₂M)^［2］。AGE-β₂M能增加人单核/巨噬细胞的化学趋化性，刺激其生成促炎症细胞因子白细胞介素1β(IL-1 β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)，因此被认为在DRA的发生中具有重要作用^［3］。此外，AGEs修饰的白蛋白具有刺激肾小球系膜细胞合成细胞外基质^［4］，增加血管内皮细胞通透性等生物学效应^［5］。

AGEs修饰蛋白与细胞的相互作用由细胞表面AGE结合蛋白所介导。现已发现，体内存在多种AGE结合蛋白，不同细胞表面AGE结合蛋白的特性有所不同，其介导的效应亦不相同^［6］。AGE受体(RAGE)是从牛肺组织中分离出来的一种新的35 000 AGE结合蛋白，存在于牛内皮细胞、人单核细胞及某些平滑肌细胞表面^［7］。最近证实，AGE-β₂M增加单核细胞趋化性及刺激其生成促炎症细胞因子等生物学效应是由RAGE介导的^［8］。我们的研究证实，人成纤维细胞表面表达RAGE，这种AGE结合蛋白介导AGE-β₂M与成纤维细胞的结合，提示成纤维细胞及相关的组织间质细胞可能是AGE-β₂M病理生物学效应的靶细胞。这一发现为研究DRA的发病学提供了新的线索。

材料与方法

一、成纤维细胞培养正常人非胎儿皮肤成纤维细胞系(GM05757A)购自NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository(USA)。细胞在含10%(v/v)胎牛血清的Dublbeccos modified Eagle medium(GIBCO, USA)中，在37℃、95%空气和5%CO₂孵育箱中培养。生长至融合期的细胞用0.1%胰蛋白酶/0.02%EDTA(Sigma,USA)消化，按1∶3进行传代。第7～12代细胞用于实验。

二、体外制备AGE-β₂MAGE-β₂M按文献［9］的方法在体外制备。简言之，1.75 mg/ml纯化的人β₂M(Cortex Biochem, USA)在含100 mmol/L D-葡萄糖，200单位/ml青霉素，70 μg/ml庆大霉素和1.5 mmol/L PMSF的磷酸缓冲液(100 mmol/L)中，于37℃下孵育30天。以同样条件，但在不含葡萄糖的孵育液中培养的β₂M作为对照。孵育结束时以无菌的pH7.4的PBS透析以除去未结合的葡萄糖。制备的样本经抗AGE抗体(John Baynes教授惠赠，South Carolina大学，USA)ELISA法和荧光分光光度法鉴定。制备的AGE-β₂M样本中，AGEs含量(荧光分光光度法)为26.4单位/mg蛋白，β₂M对照样本为0.6单位/mg蛋白。

三、成纤维细胞RAGE的识别

1.免疫印迹(Western blotting)：人皮肤成纤维细胞(HSF)RAGE的识别按文献［10］的方法采用免疫印迹法。简言之，HSFs(10⁸细胞)溶解于含Tris(20 mmol/L，pH7.4)，氯化钠(0.1 mol/L)，辛基-β-葡糖苷(1%)和PMSF(1 mmol/L)的溶液中；过羟基磷灰石色谱柱(IBF Biotechnics,USA)；柱体用0.1%辛基-β-葡糖苷的Tris缓冲液(Tris,20 mmol/L,pH7.4；氯化钠0.1 mol/L)冲洗；而后用氯化钠浓度为1 mol/L的同样缓冲液洗脱；细胞提取物经10% SDS-PAGE电泳；按Blotto法^［11］进行免疫印迹分析。印迹膜与第一抗体-兔抗人RAGE IgG(45 μg/ml,Ann Marie Schmidt医生惠赠，Columbia大学，USA)反应后，采用过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(Amersham Corp.USA)作为第二抗体，利用化学发光法显示IgG结合带。

2.免疫荧光法：HSFs在37℃下培养24小时，使其贴附于12 mm盖玻片上。贴附细胞用pH7.2 Hanks缓冲液洗3次，用2%副醛在4℃下固定15分钟。固定的细胞随后与兔抗人RAGE IgG(33.5 μg/ml)在37℃下共同孵育45分钟，洗涤后再与FITC标记的羊抗兔IgG(Sigma,USA)在37℃下反应45分钟。用荧光显微镜观察。以非免疫兔IgG代替兔抗RAGE IgG作为第一抗体进行反应的样本作为对照。

四、AGE-β₂M结合分析按照文献［8］的方法。用乳过氧化物酶法标记AGE-β₂M。标记后的特异活性为2.5×10⁴ CPM/ng。将HSFs置于96孔培养板中(2×10⁴/孔)，与不同浓度的¹²⁵Ⅰ-AGE-β₂M在有或无25倍摩尔过量的未标记AGE-β₂M的PBS中培养3小时(4℃)。在另一组实验中，HSFs与不同浓度的兔抗人RAGE IgG或非免疫兔IgG在4℃下预培养2小时，用PBS洗涤细胞后，再加入¹²⁵Ⅰ-AGE-β₂M。结合反应结束时，用4℃ PBS洗涤以中止反应。用含肝素(1mg/ml)的缓冲液在37℃下孵育5分钟以洗脱结合于细胞上的放射物质，用γ计数仪测定放射活性。以总结合活性减去非特异结合活性(加入过量未标记蛋白培养孔的结合活性)作为特异结合活性。数据用Klotz和Hunston法^［12］分析。

结果

一、HSFs表面存在RAGE为明确HSFs是否表达RAGE，我们采用抗人RAGE抗体免疫印迹法检测HSFs富含膜成份提取物中的免疫反应性物质(图1)。该提取物在免疫印迹膜上显示两条带，相对分子量分别约30 000和约50 000。HSFs提取物中存在两种不同分子量的RAGE多肽可能系翻译后过程或裂解所致。因为用全长RAGE cDNA转染的293细胞在免疫印迹时也呈现数条低分子量的RAGE带^［13］。

为了明确RAGE是否存在于HSFs表面，我们用免疫荧光法进行了检测。用兔抗人RAGE IgG作为第一抗体的染色呈现弥漫的细胞表面荧光(图2A)，而用非免疫兔IgG作为第一抗体的对照染色不呈现荧光(图2B)。

图1免疫印迹检测HSFs膜提取物中的RAGE。1.HSFs膜提取物经10%SDS-PAGE电泳，电转移，而后与兔抗人RAGE IgG(45μg/ml)反应，再经化学发光法显示结合带。2.实验步骤同1，但采用非免疫兔IgG(45 μg/ml)作为第一抗体。

图2间接免疫荧光检测HSFs表面的RAGE。A：HSFs用非兔抗人RAGE IgG染色。B：HSFs用非免疫兔IgG作为第一抗体染色。1.免疫荧光观察。2.相差显微镜下的同一细胞。标尺=10 μm。

二、RAGE介导AGE-β₂M与HSFs的结合¹²⁵Ⅰ-AGE-β₂M与HSFs共同孵育后，呈现剂量依赖的特异性结合。Kd≈86.5±9.5 nmol/L(图3)。非特异结合率均≤总结合率的25%。HSFs与抗RAGE IgG预孵育后，与¹²⁵Ⅰ-AGE-β₂M的结合