关键词： CD44；骨调素；新月体肾炎

目的探讨CD44及其配体骨调素(OPN)在实验性新月体肾炎发展过程中的表达和作用。方法应用兔抗鼠肾毒性血清制作新月体肾炎模型，免疫组化双标记及原位杂交技术检测CD44、OPN及其它指标。结果CD44和OPN在新月体肾炎的发展过程中表达明显升高，并和巨噬细胞在肾脏组织的局部浸润、新月体的形成及肾功能的损害密切相关。结论在实验性新月体肾炎模型，CD44和OPN在肾小球实质细胞和小管间质细胞显著表达，并可能在新月体肾炎的发病过程中发挥重要的作用。

CD44 and its ligand osteopontin expression in the development of rat anti-GBM glomerulonephritisYu Xueqing, Chen Weiying, Shen Qingrui, et al. Department of Nephrology, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080

ObjectiveTo investigate the expression and potential role of CD44 and its ligand osteopontin in a rat experimental crescentic nephritis.Methods Accelerated rat crescentic nephritis were induced by rabbit anti-rat GBM nephrotoxic serum. The expression of CD44, osteopontin were detected with double immunostaining and in situ hybridisation.Results CD44 and osteopontin expression were up-regulated in the development of rat anti-GBM nephritis, and closely correlated with glomerular and tubulointersitial macrophage infiltration, crescent formation and reduction of renal function.ConclusionCD44 and osteopontin were produced by intrinsic glomerular and tubular epithelial cells, and may play an important role in pathogenesis of rat experimental crescentic glomerulonephritis.

Key wordsCD44OsteopontinCrescenticglomerulonephritis

CD44是一种可在多种细胞如白细胞、纤维母细胞、内皮细胞和上皮细胞表达的膜表面糖蛋白^［1］，并在细胞与细胞之间及细胞与细胞外基质之间的信息传递过程中发挥着重要作用^［2］。已有的研究表明，CD44在T细胞和单核细胞的激活、淋巴细胞与内皮细胞的粘附以及肿瘤细胞的增殖和转移、促进创伤修复的纤维化等过程中发挥重要作用^［3～6］。在CD44的同型异构体中，CD44 V6与T细胞的激活及肿瘤的增生和转移有关^［7，8］；而V3则有硫酸肝素的结合位点，便于巨噬细胞炎症蛋白1β(MIP-1β)和纤维母细胞生长因子与CD44分子的结合^［9］。所有的这些证据表明，CD44可能在炎症过程中发挥重要作用。最近的研究更证明，骨调素(osteopontin,OPN)是CD44的主要配体和巨噬细胞的化学趋化因子，与巨噬细胞的局部浸润具有密切关系。我们应用免疫组织化学双标记染色和原位杂交的方法，探讨在巨噬细胞介导肾脏损伤为主的大鼠实验性新月体肾炎发生发展过程中CD44及其配体OPN的变化，以及上述变化和巨噬细胞在肾小球及小管间质的浸润、肾功能损害的相关关系。

材料和方法

一、实验材料Sprague-Dawley大鼠24只，雄性，体重150～200g。小鼠单克隆抗体包括OX-50(抗CD44抗体)、OX-1(抗CD45、所有白细胞的抗体)、ED1(抗CD68、巨噬细胞抗体)，用本实验室的杂交瘤细胞株制备；抗OPN抗体由美国华盛顿大学Johnson教授提供；羊抗小鼠过氧化物酶(HRP)、小鼠抗过氧化物酶(PAP)、羊抗鼠碱性磷酸酶(PAP)及抗碱性磷酸酶(APAAP)为DAKO公司产品。兔抗鼠肾小球基底膜肾毒性血清由本实验室制备。

二、加速型肾毒性血清性肾炎模型的制作所有的实验动物应用正常兔IgG(5mg/只)加完全弗氏佐剂皮下注射进行预免疫，5天后应用兔抗鼠肾小球基底膜的肾毒性血清10ml/kg体重经尾静脉注射。然后分别于第1、第7、第14和第21天留24小时尿、取血和处死动物后取肾脏组织检查。另取6只大鼠作为正常对照。

三、检测指标和方法24小时尿蛋白和尿肌酐定量以及血肌酐和尿素氮的检查送Monash医学中心生化和临床检验实验室用常规方法检测。内生肌酐清除率根据经典公式计算。CD44和OPN在肾脏组织中的表达应用免疫组化和原位杂交的方法检测。此外，CD44和OPN在肾脏组织细胞的局部双重表达以及和局部白细胞浸润的关系则应用微波炉免疫组织化学双标记染色方法。

四、组织学和免疫组织化学染色多聚甲醛(PLP)固定组织冰冻切片(6μm)或Bouin固定的蜡块切片(4μm)，凉干后用10%正常羊血清(NGS)和10%的小牛血清(FCS)磷酸盐缓冲液(PBS)孵育20分钟，然后加单克隆抗体60分钟。PBS冲洗后，用含0.3%过氧化氢的甲醛阻断内源性过氧化物酶20分钟，然后用过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG及小鼠PAP各孵育30分钟。最后用3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色。双重染色者，则先用微波炉(0.01 mol/L的枸橼酸缓冲液，pH6.0， 50 mHz，2×5分钟)处理以防抗体之间的交叉显色，以及恢复组织中待检查抗原之活性，其余步骤同前。最后在光镜下计算每个肾小球和单位面积肾小管-间质内阳性细胞的个数和百分数。肾小球新月体的形成和小管间质的损害用常规PAS染色方法。

五、原位杂交福尔马林固定组织切片(4μm)脱腊后，微波炉处理2×5分钟，0.2 mmol/L HCl孵育15分钟，接着用磷酸盐缓冲液冲洗，再用蛋白酶K消化(德国Boehringer Mannhein公司，10μg/ml)，室温20分钟。然后用2×SSC液冲洗后，预杂交2小时，接着用地高辛标记的顺义或反义的cRNA探针在50%去离子的甲酰胺，4×SSC、2×Denhardts溶液，1 mg/ml鲑鱼精DNA(Sigma公司)和酵母tRNA(德国Boehringer Mannheins公司，1 mg/ml)，杂交过夜(42℃)，最后在42℃用0.1×SSC冲洗。杂交的探针为用碱性磷酸酶标记的羊抗鼠地高辛IgG连接，并用氮蓝/X-磷酸化合物(内含2 mmol/L的左旋咪唑)显色，套染PAS后封片。

六、染色细胞的计数每个模型肾脏组织切片在高倍镜下计算20个肾小球相关抗体阳性细胞及mRNA阳性细胞数的平均数，即每个肾小球的平均数。肾小管-间质CD44和OPN的表达则计算50个高倍视野下阳性肾小管与总肾小管数的百分数。

七、统计分析方法所有资料用平均数±标准差(±s)表示，并在GraphPad Prism(美国微软件公司)统计软件程度下操作，以P＜0.05为有统计学差异的标准。

结果

一、CD44和OPN在正常大鼠肾脏组织的表达免疫组织化学染色显示，正常肾脏组织内肾小球细胞可表达少量CD44，主要位于球囊侧壁上皮细胞和肾小球内的巨噬细胞，但肾小球内罕有OPN表达(见插页图1A)。此外，髓质肾小管可有较多的CD44和OPN的表达，但偶见于皮质肾小管。

二、CD44和OPN在实验性新月体肾炎模型肾脏组织中的表达在新月体肾炎的发展过程中，我们发现CD44和OPN的表达明显增高。在注射NTS的第1天，CD44⁺ ED1⁺的巨噬细胞即明显增多，并随着疾病的进展而增加，在第14天更高。在肾小球囊壁上皮细胞高度表达CD44和OPN并引起巨噬细胞的大量聚集，导致新月体的形成(图1D、F)，表明CD44和OPN的表达与新月体肾炎的形成有密切的相关关系。

在疾病的初期，肾小管仅有少量的CD44和OPN的表达，而随着疾病进展，CD44和OPN的表达则明显升高，尤其是有病变的肾小管，如肾小管炎症扩张或萎缩者，则表达显著升高。(图1D)；而双重免疫组化染色显示，肾小管CD44或OPN阳性者，间质巨噬细胞浸润明显增多(图1E)，表明肾小管CD44和OPN的表达与间质巨噬细胞的浸润有密切的关系。同时，我们原位杂交的结果显示，CD44和OPN阳性的肾小管细胞，其CD44 mRNA和OPN mRNA的表达也明显增高(图1B、C)，进一步说明增高的CD44和OPN是由这些细胞自身分泌的。

免疫组化双重染色显示，CD44和OPN的表达有明显的相关性。有CD44表达的肾脏组织细胞和肾小管，几乎均有OPN的表达(图1D)，并与巨噬细胞的浸润具有密切的相关关系(图1E、F)，表明CD44及其配体OPN的相互作用，可能在新月体肾炎的发展过程中发挥着重要作用。

三、CD44和OPN的表达与巨噬细胞在肾组织内浸润的关系有新月体肾炎的发病过程中，我们的研究结果显示，肾小球与小管内CD44⁺、OPN⁺的细胞数与肾小球及小管-间质内OX1⁺、ED1⁺的浸润细胞数明显相关，见附表图2、图3。

四、CD44和OPN与肾功能损害及肾脏组织损伤的相关关系血、尿生化检查显示，在注射NTS后，大鼠模型尿蛋白明显增多，血肌酐明显升高，肌酐清除率明显下降。肾脏组织内肾小球CD44⁺细胞数与内生肌酐清除率、OPN⁺的细胞数与蛋白尿及内生肌酐清除率有明显的相关关系。同时，肾小管间质CD44⁺和OPN⁺的百分数与上述肾功能的指标具有更明显的相关关系，见附表、图2、图3。

图1A正常肾脏组织肾小球可表达少量CD44(棕红色)，皮质肾小管也有一定量的表达；皮质肾小管偶有OPN的表达而肾小球罕有OPN的表达图1B原位杂交显示新月体肾炎模型肾小球及肾小管均有较多的CD44表达(第14天)。图1C