关键词： 脂蛋白(a)；肾小球系膜细胞；血小板活化因子；乳酸脱氢酶

目的探讨脂蛋白(a)［Lp(a)］对肾小球系膜细胞(GMC)的作用。方法将体外培养的系膜细胞，加脂蛋白(a)刺激后，测定细胞生长率和细胞上清中血小板活化因子(PAF)、肿瘤坏死因子(TNF)、乳酸脱氢酶(LDH)及纤维连结蛋白(FN)水平，并以未经刺激者作对照。结果经脂蛋白(a)刺激48小时，在终浓度5～20 mg/L时细胞生长率轻度增加，而在50～400 mg/L时细胞生长率明显下降。刺激18小时，细胞上清中PAF的水平明显高于对照，且与脂蛋白(a)浓度呈明显正相关(r=0.937，P＜0.01)；L929细胞的杀伤率有所增加，但未达50%；LDH的水平在脂蛋白(a)100 mg/L以下时有所增加；刺激18、48、72小时后的细胞上清纤维连结蛋白均为阴性。结论脂蛋白(a)对系膜细胞体外增殖有低浓度轻度促进、高浓度抑制的双向作用，对细胞PAF的产生具有浓度依赖的促进作用，并能增加细胞上清中LDH及TNF水平，因而可通过多种途径介导肾小球损伤。

The effect of lipoprotein (a) on human glomerular mesangial cells

Wang Xiaoyan^*, Pan Xiaoqin, Gao Yuanfu, et al. ^* Department of Pediatrics, Jinling Hospital, Nanjing 210002

ObjectiveTo investigate the effect of Lp(a) on human glomerular mesangial cells (GMC).MethodsAfter human GMCs were stimulated by media with Lp(a), levels of cell growth rates (CGR) and quantities of PAF, TNF, LDH and FN in the supernates were determined, and compared with those of the cells cultured in media without Lp(a).ResultsLevel of CGR increased between 5～20 mg/L of Lp(a), but decreased between 50～400 mg/L. Quantities of PAF in the supernates were obviously increased, related linearly with concentrations of Lp(a) (r=0.937, P＜0.01). L929 cell mortality of the supernates was higher than controls, but less than 50%. LDH releases increased at Lp(a) concentrations less than or equal to 100 mg/L. FN in the supernates of cells stimulated for 18, 48, or 72 hours was negative.ConclusionLp(a) can affect GMC proliferation and increase PAF or LDH, perhaps, TNF productions of human GMCs cultured in vitro, especially promote PAF synthesis concentration-dependently. There are no effects on FN synthesis discovered. Lp(a) induce injuries on glomerular mesangial cells in many ways.

Key wordsLipoprotein(a)Glomerular mesangial cellPAFLDH

高脂血症是肾病综合征、各类慢性肾小球肾炎以及某些继发性肾损害最常见的表现。国内外学者多认为它与肾小球疾病的慢性进展有关，并认为肾小球硬化与冠脉硬化的形成具有相似的机制。Lp(a)是一种可介导冠脉硬化的危险因子，然而，对其在肾小球病变中的作用却缺乏应有的研究。我们在本实验利用体外培养的人GMC，观察了Lp(a)刺激后该细胞的增殖水平以及细胞上清液TNF和LDH及FN的变化，以探讨Lp(a)在肾小球系膜细胞损伤中的作用。

方法

一、人血Lp(a)的分离及鉴定^［1］取富含Lp(a)空腹血清100 ml，经溴化钾调整密度至1055 g/L，15℃，48000 r/min超速离心24小时，弃顶层密度小于1055 g/L部分，再次调整密度至1 110 g/L，5000 r/min离心22小时，取密度为1055、1110 g/L部分，经30%聚乙二醇浓缩，过Sepharose 6B柱层析，取第一峰，以30%聚乙二醇浓缩0.1 mol/L甘氨酸-NaCl缓冲液透析24小时。并经Lp(a)抗血清双向免疫扩散法及PAGE电泳法鉴定和凯氏定氮定量。

二、人肾小球系膜细胞(GMC)的培养^［2］取肾肿瘤切除术后的正常部分肾脏，常规分离肾小球(纯度＞95%)，用0.15%胶原酶Ⅳ(Sigma)消化30分钟，接种于塑料培养瓶(Nunc)，以含20%灭活小牛血清的RPMI 1640(每100 ml含转铁蛋白、胰岛素5 μg，青、链霉素各100 U)培养，15～20天后传代。实验所用细胞为3～4代细胞，每次细胞均采用同一批细胞，并重复三次以上。

三、细胞增殖水平的测定^［2］取3～4代的GMC 5×10⁵/ml，接种于96孔细胞培养(Nunc)，每孔0.1 ml，24小时后换无血清RPMI 1640，使细胞同步，加用RPMI 1640配制的不同浓度Lp(a)刺激并以未加刺激者作为阴性对照，48小时后，酶标仪波长570处测定细胞摄入四唑蓝(MTT)后的吸光度(A₅₇₀)。增殖水平用细胞增长率(CGR，即刺激孔A₅₇₀/对照孔A₅₇₀×100%)表示。

四、细胞上清PAF的测定^［3］收集经Lp(a)刺激后18小时的细胞上清，经氯仿甲醇混合液抽提脂质，用薄层层析法分离出PAF，以血小板聚集仪测定PAF的含量。

五、细胞上清TNF的测定^［4］用L929细胞生物活性测定法测定经Lp(a)刺激后18小时的细胞上清中TNF的含量，L929标准株由南京医科大学微生物教研室所提供。L929细胞杀伤率为(1-样本孔A₅₇₀/对照孔A₅₇₀)×100%。

六、细胞上清LDH的测定^［5］细胞经刺激18小时或48小时后，收集上清，用全自动生化分析仪测定LDH含量。乳酸脱氢酶释放率(LRR)为样品与对照LDH均值百分比。

七、细胞上清FN的测定经Lp(a)刺激后24、48、72小时，收集上清，用火箭蛋白电泳测定其FN的含量。FN抗血清和标准品均购自上海生物研究所。

八、数据处理所有结果均以平均值±标准误表示。部分结果的比较采用Student t检验和直线相关分析。

结果

一、GMC的确认GMC呈梭形或多角形，有分枝相互连接成网，胞浆内有较多颗粒，单克隆抗体(华美生物制品公司进口分装)间接免疫荧光染色显示：desmin、vimentin和collagen Ⅳ免疫荧光染色阳性，keratin阴性。

二、Lp(a)对GMC增殖水平的影响我们发现经终浓度5～20 mg/L的Lp(a)刺激后48小时，GMC的CGR较对照有轻度增加，但在50～400 mg/L时，CGR则明显下降。

三、Lp(a)对GMC上清PAF含量的影响经Lp(a)刺激后18小时的上清中，PAF水平均较阴性对照升高明显，在Lp(a)浓度≤200 mg/L时，PAF的升高几近直线，经直线相关分析，Lp(a)浓度与PAF水平呈明显正相关(r=0.937,P＜0.01)。

四、Lp(a)对GMC上清TNF含量的影响尽管经Lp(a)刺激的细胞上清对L929细胞的杀伤率均未达50%，但仍较对照为高。

五、Lp(a)对GMC上清LDH含量的影响刺激后18小时，GMC上清中LDH的水平在Lp(a)浓度20、50和100 mg/L时分别为27±1.2，22±1.4，22±0.8，均高于对照17±1(单位U/L，P值均小于0.05)，200～400 mg/L时则无增加。

六、Lp(a)对GMC上清FN的影响经Lp(a)刺激24、48、72小时，GMC上清中FN的含量均为阴性。

讨论

Lp(a)具有与低密度脂蛋白(LDL)相似的脂质成份，尽管在电泳、化学组成、免疫活性、甚至能与LDL受体相结合等方面均与LDL相近，但Lp(a)是一种不能与其他脂蛋白相互转化的独立的脂蛋白。人们发现Lp(a)较LDL更易致胆固醇脂化，在形成泡沫细胞及随后的动脉硬化粥样斑中具有更为重要的病理意义，并认为它是心绞痛发作的危险因子，这些作用与Lp(a)中独特的载脂蛋白(a)［Apo(a)］密切相关^［6～8］。然而，对其在肾小球疾病中的作用却所知甚少。

我们的实验显示：经较低浓度的Lp(a)(5～20 mg/L)作用后，GMC的增殖水平有所增加，但较高浓度(50～400 mg/L)时，其水平则明显下降。说明Lp(a)对肾小球系膜细胞具有低浓度促进和高浓度抑制的双向作用。推测Lp(a)中的脂质，可通过细胞的有关受体^［7］(如LDL受体)被摄取，从而增加细胞的能量代谢，表现出细胞增殖的增加或细胞的过度肥大。但Lp(a)的进一步增加，因脂质对细胞的毒性，可引起细胞中毒甚至死亡。Lp(a)在浓度≤100 mg/L时可增加细胞上清中LDH的含量，而更高浓度时，由于在早期即可能有大量细胞死亡，导致LDH水平在作用后18小时反而下降。Lp(a)影响GMC增殖的机制尚有待于进一步的研究。

本实验中，上清中PAF水平与Lp(a)的浓度呈明显正相关(r=0.937,P＜0.01)。既往的研究证实，Lp(a)中的Apo(a)的基因位点位于6q^26～27，与纤溶酶原的位点6q^22～27重叠，其4 592个氨基酸组成中，有37个氨基酸序列与纤溶酶原的第四环状结构一