关键词： 外周血单个核细胞；肾上球上皮细胞；细胞外基质

目的为了明确免疫细胞对肾小球上皮细胞(glomerular epithelial cell GEC)合成功能的直接作用。方法应用肾小球细胞体外培养，同位素掺入及放射免疫技术，以总胶原，层粘连蛋白，Ⅲ型前胶原及Ⅳ型胶原的合成为观察指标，动态研究了不同病理类型原发性肾病综合征(INS)患儿外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)对GEC生物功能的影响。结果(1)肾病极期未经激素治疗组(未治组)PBMC上清明显促进了GEC合成层粘连蛋白；(2)未治PBMC上清抑制了GEC合成总胶原；(3)未治组PBMC上清促进了Ⅲ型前胶原的合成，而对Ⅳ型胶原的合成无明显影响；(4)肾病患儿PBMC的上述作用与是否足量激素治疗有关，而与尿蛋白能否阴转、肾组织病理类型、肾病临床类型等无直线相关关系。结论原发性肾病患儿循环免疫细胞可影响GEC合成细胞外基质的功能。免疫细胞的这种活性可被激素治疗改变。

The effect of immune cell from nephrotic children on the matrix synthesis of glomerular epithelial cell

Wang Dan, Ma Henghao, Zhang Jie, et al. Pediatric Department, Liu Hua Qiao Hospital, Guangzhou 510010

ObjectiveTo identify the effect of peripheral blood mononuclear cell(PBMC) on the matrix synthesis of glomerular epithelial cell(GEC).MethodsThe glomerular cell culture、³ H-prolin incorporation and radioimmunoassay were used to investigate the change of production of collagen, laminin, collagen Ⅲ and collagen Ⅳ by GEC treated by supernatant of PBMC from (1) the children with heavy proteinuria before prednison treatment (nontreatment group); (2) the children with heavy proteinuria after, at least 2 weeks prednison treatment (treatment group); (3) nephrotic children with negative proteinuria (negative group); and (4) normal children.Results(1) the laminin synthesis was significantly improved by PBMC from nontreatment group (P＜0.05); (2) the ³ H-prolin incorporation was significantl decrease in the GEC treated by PBMC supernatant from nontreatment group(P＜0.05); (3) the supernatant of PBMC from nontreatment group stimulated the collagen Ⅲ synthesis(P＜0.05), while, there was no significant difference of collagen Ⅳ synthesis between 4 groups; (4) the activity of PBMC supernatant have no close relation with urinary protein excretion, pathological type and clinical type.ConclusionFactors produced by immune cell from children with idiopathic nephrotic syndrome can regulate the matrix synthesis of cultured rat GEC. Such activities of nephrotic immune cell can be changed by prednison treatment.

Key wordsNephrotic syndromePeripheral blood mononuclear cellGlomerular epithelial cellMatrix

近十年的研究显示肾病患者(儿)免疫细胞培养上清可致大鼠的蛋白尿，并诱使大鼠肾小球发生类似人类微小病变型肾病的形态改变^［1，2］。更有研究发现，用吸附法去除肾病患者的循环免疫物质，可大大减少患者的尿蛋白，而被吸附物物质注入动物则可致蛋白尿^［9］。上述临床和实验室的观察验证了免疫细胞产物对肾小球细胞功能的影响，但其机制尚不明了。

EGC合成的细胞外基质参与了肾小球基底膜特有的“中间致密、内外稀疏”的网状结构的组成，赋于基底膜选择性通透功能，并且参与了肾小球细胞与基底膜的固着^［3，7］，稳定了肾小球的结构。GEC合成功能的改变将导致肾小球通透功能受损而出现蛋白尿。为了从细胞水平认识免疫细胞与肾小球细胞的相互作用，明确免疫细胞产物对GEC合成功能的直接影响，我们观察了原发性肾病患儿外周血单个核细胞(PBMC)产物对体外培养的大鼠GEC合成层粘连蛋白(LN)、总胶原及胶原种类的作用。

材料与方法

一、材料³ H-prolin(羟脯氨酸)为中国原子能研究所产品；LN及Ⅳ型胶原放射免疫分析检测盒为上海海军医学研究所生物技术中心产品；Ⅲ型前胶原放射免疫分析盒为重庆市肿瘤研究所中心研究室产品；SD大鼠为本院实验动物中心养殖。

二、方法

1.病人及分组：INS患儿28例，临床表现为单纯型的20例，肾炎型8例；23/28名接受了肾活检，病理诊断为系膜增殖型肾小球肾炎者12例，轻微病损者9例，微小病变型肾病者1例，膜性肾病(Ⅰ型)者1例。所有诊断符合1979年全国儿科肾脏病协作组制定的诊断标准。

分组：Ⅰ组肾病极期，两个月内未经激素类药物治疗者(未治组)8例；Ⅱ组肾病极期，足量强的松治疗二周以上者(激素组)15例；Ⅲ组足量强的松治疗尿蛋白转阴2周以上者(阴转组)19例；Ⅳ组正常对照组(对照组)15例。

2. PBMC上清液的制备：肝素抗凝静脉血，淋巴细胞分离液分出PBMC。调整细胞密度为1～2×10⁶/ml。加入ConA 10 mg/L。孵育48小时，离心，收集上清。

3.大鼠GEC体外培养：SD大鼠，体重100～ 150克，清洁取肾，顺序过筛法获取肾小球，培养于10%胎牛血清(FCS.K1)液中。待GEC以肾小球为中心铺展成片时，进行转种传代。第2代纯化GEC用于实验^［4］。实验所用GEC形态观察为多角型，desmin免疫萤光为阴性，cytokeratin免疫萤光为阳性，嘌呤霉素氨基核苷毒性实验为阳性。符合文献［6，8］记载大鼠GEC特征。

4. PBMC上清对GEC合成LN的影响：第2代GEC(细胞密度3～5×10³/孔)中加入PBMC上清(0.1 ml/孔，终浓度50%)，以10%FCS.K1液为阴性对照，24小时换液一次，收集48小时孵育液，竞争性放射免疫分析法测取LN含量。主要步骤：(1)竞争性结合：将待测样本、¹²⁵ Ⅰ-LN及抗LN血清共同孵育，使样本中的LN竞争¹²⁵Ⅰ-LN与一抗的结合；(2)分离：前述混合液中加入抗LN抗体的抗血清(二抗)，充分孵育致LN-一抗-二抗复合物形成；(3)计数：γ计数仪测读复合物中¹²⁵ Ⅰ计数。

5. PBMC上清对GEC掺入³ H-prolin的影响：第二代GEC中加入PBMC，24小时后加入³H-prolin，1 μCi/孔，继续孵育24小时，收获GEC，液闪仪测读每孔³ H掺入值。

6. PBMC上清对GEC合成Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原的影响：同方法4。

7.统计：(掺入)抑制指数=样本管min^-1值/阴性对照管min^-1值。Excel程序，t检验法计算各组间(抑制)掺入指数差异及其显著性。P＜0.05为具显著性差异。

结果

一、肾病患儿PBMC上清对GEC合成LN的影响未治组患儿PBMC上清作用后GEC抑制指数(0.953 9±0.016 5)明显低于激素组(1.018 7±0.055 7)、阴转组(1.008 8±0.059 2)及正常组(1.036 9±0.030 3)、(P值均＜0.05)；后三组指数间无显著差异(P＞0.05)。因为LN测定方法为竞争抑制法，此处未治组的低指数表示其合成能力高于其它各组。

二、肾病患儿PBMC上清对GEC合成总胶原及Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原的影响。

1.对GEC合成总胶原(掺入³ H-prolin)的影响：见附图。结果显示未治组PBMC作用后的GEC掺入指数明显低于激素组、阴转组及正常组(P＜0.05，分别为0.04、0.04和0.03)后三组间合成指数无显著性差异(P＞0.05)。

2.对GEC合成Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原的影响：PBMC作用后GEC合成Ⅲ前胶原未治组的抑制指数(0.969 1±0.009 1)明显低于激素组(1.000 8±0.053 6)、阴转组(0.992 7±0.036 9)及正常组(1.008 6±0.024 9)(P＜0.05)，后三组指数间无显著差异。Ⅳ型胶原抑制指数4组间无显著性差异，分别为1.037 0±0.013 5、1.045 9±0.051 1、1.043 9±0.050 9和1.076 7±0.060 1(P＞0.05)。

附图PBMC上清对GEC掺入³ h-prolin的影响

讨论

一、INS患儿免疫细胞对GEC的直接作用肾小球上皮细胞经由两个机制维持了肾小球滤过膜的通透功能：(1)GEC胞浆中丰富的细胞骨架蛋白的收缩作用稳定了GEC足突“指状突起”的结构，保证了肾小球的滤过面积和足突裂隙横膈“细滤器”的数量^［6］；(2)GEC可以合成胶原、糖蛋白、蛋白多糖等细胞外基质。基底膜的细胞外基质为细胞的固着提供了基础框架，并可作为盐类和小分子物质的滤过膜^［6，8］。其中Ⅳ型胶原和层粘连蛋白的“同种多聚体网络”是基底膜组成的二个重要系统，是“分子屏障”的物质基础。蛋白多糖物质的生物作用一则是作为此“同种多聚体”自身及两个多聚体间的连接成份，二则是提供了GEC表面的阴电荷，形成“离子屏障”。当GEC合成基质功能受损时，滤过膜的“分子屏障”和“离子屏障”作用均减弱