关键词： 成人型多囊肾病；聚合酶链反应；定位克隆；染色体跳跃

目的为了分离成人型多囊肾病致病基因PKD1区近侧端新的探针。方法采用定向跳跃克隆PCR技术分离了一个DNA片段，通过反向PCR、缺失杂交定位，限制性内切酶谱分析以及DNA序列分析，并与PKD1区物理图谱及最新的DNA数据库比较。结果证实该克隆片段是一个新的DNA序列，位于PKD1区NK92.6SH1.0近侧的Mlu Ⅰ位点处，距克隆起始位点AJ1约40kb。结论由于该位点位于PKD1可能存在的另一候选基因的潜在区域内，故可作为进一步筛选PKD1新候选基因的探针使用。

Positional cloning of a novel DNA fragment in the region of PKD1

Yu Yulu, Zhang Sizhong. Department of Medical Genetics, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041

ObjectiveTo confirm the possibility that another candidate gene may exist likely mapped near the locus of NK92.6 SH1.0 in PKD1 region.MethodsUsing oriented jumping cloning PCR, a DNA fragment expected to be around the Mlu Ⅰ site, which is about 40kb distal from the jumping point (AJ1 locus) and 10kb proximal to NK 92.6 SH1.0 locus, has been cloned.ResultsIts genomic location expected was supported not only by the evidence from inverse PCR, but also by those from experiments of deletion hybridization and restriction mapping.ConclusionThis cloned fragment could be used as a probe in selection of the new PKD1 candidate gene or other neighbouring genes in PKD1 region.

Key wordsAdult dominant polycystic kidney diseasePCRPositional cloningChromosome jumping

成人型多囊肾病(adult dominant polycystic kidney disease, ADPKD)是一种发病率高达1/1 000、并有遗传异质性的常染色体显性遗传病。迄今已发现有两个不同的致病基因，即PKD1(polycystic kidney disease 1)和PKD2与其发病有关。

PKD1是本病最常见的致病基因，约有85%患者的发病是由于PKD1缺陷所致^［1］。该基因于1985年被定位于人类第16号染色体短臂16 p13.3处，与α珠蛋白基因簇紧密连锁。已经发现，PKD1所在的、大约750 Kb的DNA区域，是一个基因高度富集区，估计至少包含了二十个以上的基因。尽管在该区域内已经发现了较多的遗传标记位点，并绘制了较详细的稀有切点限制酶谱，但已经克隆和鉴定的基因为数不多，且进展缓慢，影响PKD1的分离鉴定^［2～4］。

1994年6月，通过对一个特殊的染色体易位型患病家系的分析，才发现了一个最有希望的PKD1候选基因，即多囊肾断裂点(polycystic break point, PBP)基因^［5］。但PBP基因是否为PKD1唯一的候选基因尚有疑问。Somlo^［4］等通过对8个PKD1型ADPKD家系的重组位点分析发现，有5次重组发生在NK92.6 SH1.0(后简称NK)位点的远侧端，但有一次发生在其近侧端，因此不排除在NK位点的近侧区有PKD1候选基因存在的可能；此外，对300余例PKD1型本病患者PBP基因的分析结果，仅发现了共13例突变^［5～8］，其突变检出率之低，也提示另有候选基因存在的可能。

我们采用一种染色体跳跃克隆策略，即定向跳跃克隆PCR技术，以位于NK近侧约90Kb远的质子泵基因AJ1为起点，克隆了一个位于NK位点近侧约40Kb远的DNA片段，旨在为PKD1候选基因的分离克隆提供新的探针，报道如下。

材料与方法

一、材料

1.人鼠杂种细胞株DNA：CY14、CY18和CY190细胞株DNA，由澳大利亚阿德雷德妇儿医院的Callen教授惠赠。CY18只含有一个人类染色体，即单个完整的人类第16号染色体。CY14和CY190的人类第16号染色体有包括PKD1区在内的短臂末端的缺失(图1)。

2.引物设计合成：参照AJ1基因5′末端的DNA序列，设计两对套式反向引物，P1/P2和P3/P4(图1)。其序列分别为：P1，5′CAT GAC CTG GCC CCG CCC CTG 3′；P2，5′CGC CGC ATT TTG TTC TGC GGT GCT GG 3′；P3，5′GTA CCC ACT TCG CAC CGT 3′；P4，5′ATT TAG AGC GCA CGC TGAC3′。引物由中国科学院上海细胞所合成，电泳纯。引物干粉用超纯水稀释成12.5 μmol/L的混合液，-70℃冻存备用。

3.酶等精密试剂：MluⅠ、TaqⅠ、BamHⅠ、Hind Ⅲ、T₄DNA Ligase、random primer DNA labe-ling system、dsDNA cycle sequencing system以及测序用常规试剂购于GIBCO BRL公司，Wizard^TM PCR preps DNA purification system购于Promega公司，TaqDNA聚合酶及α-³²P-dCTP、γ-³²P-ATP分别购于中国科学院遗传所和北京亚辉生物工程公司。

二、方法

1.高分子量基因组DNA的纯化：参照J.Sambrook等介绍的透析法略加修改：抽取抗凝静脉血10 ml，离心去血浆，用巴氏吸管将白细胞层转移到一个加有15 ml抽提缓冲液(10 mmol/L Tris. Hcl pH8.0, 0.1 mol/L EDTA pH8.0, 20 μg/ml RNase A, 0.5% SDS)新的离心管中，置37℃温育1小时。加蛋白酶K至终浓度为100 μg/ml，于50℃水浴3小时，分别用酚、酚/氯仿以及氯仿各抽提一次，用大口径吸管小心地将水相全部转移到透析袋中，并用1升透析液(50 mmol/L Tris. Hcl pH8.0, 10 mmol/L EDTA pH8.0)于4℃冰箱中透析，每12小时更换一次透析液，共四次。最后用灭菌三蒸水透析12小时，紫外分光光度计法定量后立即使用。

2.反向PCR试验：基因组DNA用TaqⅠ完全酶切后，按Ochman等^［9］介绍的方法使之自身连接环化，煮沸线性化后用做PCR模板，并在不同的预试条件下进行P1/P2及P3/P4套式(nested)PCR。经凝胶电泳检测比较扩增结果后，即可确定较优的PCR条件。然后在相同的条件下，以未经环化处理的人基因组DNA为模板进行PCR扩增，其结果作为阴性对照，以排除非特异性扩增的干扰。本研究所有的PCR均在PE公司的TC-1型DNA热循环仪中完成，其较优的反应条件分别为：P1/P2，94℃1分钟，64℃45秒，72℃2.5分钟，40个循环；P3/P4，94℃1分钟，54℃45秒，72℃3分钟，35个循环。

3.定向跳跃克隆PCR：提纯的高分子量基因组DNA同前述方法，经Mlu Ⅰ和Taq Ⅰ两次单酶切、连接环化后按上述已确定的条件进行套式PCR，并设以未经环化处理的人基因组DNA为模板的阴性对照，其原理见图1。

4.缺失杂交定位：人鼠杂种细胞株CY14、CY18和CY190 DNA经BamHI及Hind Ⅲ双酶切后，常规法电泳分离及Southern转移，并以随机引物法标记³² P的克隆片段为探针与之杂交，曝光显影，测量杂交带的电泳距离，再用曲线拟合法计算杂交片段的分子量。

5.酶谱分析：跳跃克隆PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳分离、纯化及紫外分光光度计法定量之后，分别取0.5 μg纯化产物用于Mlu Ⅰ、Taq Ⅰ单酶切，然后以PBR 322/Hae Ⅲ为分子标识、非酶切纯化产物为对照，在7%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，经溴化乙啶染色或银染后分析酶切结果。

6. DNA序列分析：以纯化的克隆片段为模板、P3为测序引物，按双链DNA循环测序试剂盒推荐的条件略加修改进行测序反应。常规测序电泳分离2～3小时，湿胶压片，-70℃曝光、显影。将测出的序列在Internet网中进行同源序列检索。

图1染色体定向跳跃克隆原理

E1和E2分别为MluⅠ和TaqⅠ位点：P1～4为套式引物，箭头示其3′末端方向；斜框区为跳跃起点JA1基因的5端；黑框区为拟克隆的DNA区段，本文中两E1间的距离约40kb，其后一个E1(MluⅠ)位点离JA1约为300kb；CY18，CY14，CY190，为人鼠杂种细胞株，前者含单个完整的人类16号染色体，后两者的16号染色体有PKD1区至染色体末端的缺失；弧箭头示克隆方向。

图2定向跳跃克隆PCR

M. 123bpLadder；2～5栏DNA模板量分别为100、80、60、40ng；6栏为阴性对照。特异性产物约450bp。

图3缺失定位杂交

1～3栏分别为CY14、CY190、CY18 DNA杂交带位置为7.44kb

图4酶切位点分析

M. PBR322/HaeⅢ；1栏未经酶切的克隆片段，约450bp；2、3栏分别为MluⅠ和TaqⅠ酶切后的结果，分子量略变小。

结果

一、反向及定向跳跃克隆PCR本文反向PCR试验中可见一