摘要目的：探讨营养不良、肾病本身和糖皮质激素作为各自独立因素对大鼠血清胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）浓度的影响，阐明血清IGFBPs代谢紊乱与肾病综合征（NS）大鼠生长障碍的关系。方法：24只周龄相同体重相近的雄性SD大鼠被随机分成正常、食物对照、阿霉素（5 mg／kg）肾病和地塞米松（1.8 mg／kg·d^－1）治疗的阿霉素肾病四组。血清IGFBPs浓度和肝脏IGFBPs mRNA表达分别采用 Westernligandblot和RT-PCR法检测。结果：①食物对照和肾病组大鼠血清IGFBP-3浓度均减低，且肾病组更明显；激素治疗组较肾病组则增高。食物对照组大鼠血清IGFBP-2浓度也减低，肾病和激素治疗组却显著增高，但后两组间差异不显著。②食物对照组大鼠肝脏IGFBP-2 mRNA表达下降，肾病组升高，激素治疗组较肾病组减低。食物对照组大鼠肝脏IGFBP-3mRNA表达正常，肾病组减低，激素治疗组较肾病组进一步下降。③血清IGFBP-2浓度与大鼠鼻-尾长度和体重均呈负相关（P均＜0.01）。结论：肾病本身所致的血清IGFBP-2浓度增高是NS大鼠生长障碍发生的重要因素之一。

SERUM INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR BINDING PROTEIN（IGFBP）AND LIVER IGFBP mRNA IN NEPHROTIC RATS WITH GROWTH FAILURE

LIU Jianhua，YI Zhuwen

（Department of Pediatrics，The Second Affiliated Hospital，Hunan Medical University，Changsha，410011）

OBJECTIVE To investigate the changes of insulin-like growth factor binding proteins（IGFBPs）in nephrotic rats and to exam its relationship with the nephrotic state，nutritional state，and steroid treatment．METHODOLOGY Twenty-four male Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into control group，pair-fed group，doxorubincin-induced nephrotic group（nephrotic group）and dexamethasone-treated nephrotic group（des-treated group）．Serum IGFBPs and liver IGFBPs mRNA were measured by Western blot and RT-PCR respectively．RESULTS Serum IGFBP-2 and IGFBP-3 were found significantly reduced in pair-fed rats（2.05±0.21，P＜0.01；16.42±1.44，P＜0.01），nephrotic rats（6.75±0.57，P＜0.01；8.13±0.99，P＜0.01）and des-treated nephrotic rats （6.44±0.51，P＜0.01；21.29±2.05，P＜0.01）as compared to the control rats．No significant difference of both IGFBPs was found between the nephrotic and des-treated nephrotic rats．Liver IGFBP-2 mRNA was found decreased in pair-fed rats and increased in nephrotic rats as compared to the control rats．Significant increase of liver IGFBP-2 mRNA was found in nephrotic rats as compared to the des-treated rats．No significant difference of liver IGFBP-3 mRNA was found between the pair-fed rats and the control，while significant decrease of liver IGFBP-3 mRNA was found in nephrotic and des-treated nephrotic rats，with the later of more obviouse decrement．A significant negative correlation was found between the nose-tail length or body weight and serum IGFBP-2． CONCLUSION Increased serum IGFBP-2，induced by nephrosis itself，is one of the causes for growth failure in nephrotic syndrome．

Key words growth failure nephrotic syndrome insulin-like growth factor binding protein

尽管许多研究已证实，反复发作的肾病综合征(NS)患儿生长障碍与血清胰岛素样生长因子I（IGF-I）浓度减低有关，然而，由于NS时常伴随的继发性营养不良及随后的糖皮质激素治疗，也对血清IGF-I代谢产生影响，因而使得人们难以准确地认清其发生机制。的确，Haffner^［1］最近的研究就发现，营养状态良好的NS患儿其血清IGF-I浓度在年龄相关的正常范围之内。这就使人们联想到，NS患儿生长障碍可能还有其它发生机制。胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)作为IGF-I在血清中储存、运输及至靶器官发挥生物效应的载体，除了通过调节IGF-I半衰期影响其在血清中浓度外，可能也通过抑制其生物活性^［2］而参与NS生长障碍的发病过程。为验证这一假设，本研究采用动物实验，通过观察营养、肾病和糖皮质激素作为各自独立因素对IGFBPs合成和代谢的影响，以期阐明IGFBPs发生紊乱的机制及其紊乱与生长障碍的关系。

1材料和方法

1．1动物实验及标本采集24只6周龄、体重在190～240g的雄性SD大鼠（购自中国科学院上海实验动物中心）被随机分成：正常对照（Control，5只），食物对照组（Pair-fed，5只），肾病（Nephrotic，6只）和激素治疗的肾病（Des-treated，8只）四组。肾病模型通过实验第一天尾静脉一次注射阿霉素（5mg／kg，意大利爱宝大药厂）法制备；激素治疗的肾病组，自实验第二周末开始，皮下注射地塞米松（1.8mg／kg*d^－1）至第四周末实验结束；余下各组注射等量生理盐水做对照。

在整个实验过程中，所有大鼠均被饲养在12h白昼、12h黑夜的标准温度（21～22℃）和湿度（50％～70％）环境中，均食用我院动物实验中心自产的全价颗粒饲料和自来水。除食物对照组大鼠喂养肾病组等量饲料而作为继发性营养不良模型观察外(按每只大鼠每天平均摄食量计算，食物构成不变)，余各组自由进食。

在实验初和实验末，所有大鼠均于乙醚麻醉下测量体重和鼻-尾长度，并将其单个地置入代谢笼中收集24h尿标本，离心后取上清置－20℃冰箱保存。实验第四周末，在乙醚麻醉下，从腹主动脉取血，分离血清置－20℃冰箱保存，并切取0.5g左右肝组织在液氮中速冻后置－70℃冰箱保存。

1．2检测方法

1．2．1探针标记rhIGF-I（Promega）和rhIGFBP-3（湖南医科大学内分泌研究所廖二元教授馈赠）参照文献［3］方法用¹²⁵I－Na标记，标记产物分别经2×40和1×30cmSephdexG-50（Pharmacia）层析柱纯化，终产物特殊的比放射活性为150和670 μCi／μg。

1．2．2血清IGF-I浓度按试剂盒（DSL-2900）说明采用放射免疫法检测。

1．2．3血清及尿IGFBP-2，-3浓度：参照文献［4］报道，采用Westernligandblot法检测，并略加修改：5μl血清或尿标本加入30μl1×SDS上样缓冲液中100℃变性3～5min后，加样于12%聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上90V电压电泳10h，再于240mA电流下转膜8h，硝酸纤维膜经含3％NonidetP-40（Sigma）、0.1％Tween-20（Sigma）和1％BSA的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）封闭后，与3×10⁶／min¹²⁵I-IGF-I在4℃下孵育24h，将膜漂洗并干燥，放入带增感屏的暗盒中置－70℃冰箱，分别曝光10天或14天。

1．2．4血清及尿IGFBP-3蛋白酶活性检测方法参照文献［4］报道并稍加修改：5μl血清或3μl尿标本中加入1×10⁶／min¹²⁵I-IGFBP-3和PBS缓冲液（含2mmol／LCaCl₂）至总体积25μl，37℃水浴下分别孵育6h和2h后，加20μl1×SDS上样缓冲液100℃变性3～5min，上样于12％聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）90V电压电泳8h，待凝胶自然干燥后，放入带增感屏的暗盒中至－70℃冰箱，分别曝光4天或7天。

1．2．5肝组织IGFBP-2，-3mRNA表达采用RT-PCR法检测。IGFBP-2，-3、内参照β-actin引物由上海生物工程研究所合成，其寡核甘酸序列分别为：IGFBP-2上游5-TGGAGGAGCCCAAGAAGCT-3下游5-GGTTCACACACCAGCACTC-3扩增产物228bp；IGFBP-3上游5-AGAACTTCTCCTCCGAGTC-3下游5-CTTTGGAAGGGCGACACTG-3扩增产物174bp；β-actin上游5-TGACGTTGACATCCGTAAAG-3下游5-ACAGTGAGGCCAGGATAGAG-3扩增产物194bp。

(1)RNA提取：100mg左右肝组织按TRIZOL（GIBCO）试剂说明书进行提取，并经紫外分光光度计测定其纯度。

(2)逆转录：按试剂盒说明采用S_UPERS_CRIPT^TM反转录系统（GIBCO）合成cDNA第一链。

(3)PCR扩增：取2μlcDNA模板，依次加入5μl10×PCR-Buffer、3μl25mmol／LMgCl₂、1μl10mmol／LdNTPs、0.5μl25μmol／LIGFBP-2或-3和β-actin引物，及2UTaqDNAPolymerase，用去离子水补充至总体积50μl；IGFBP-2，-3扩增条件均为95℃2min，95℃30s、56℃30s、72℃30s、共30个循环，72℃5min。

取扩增产物3～5 μl，在10％聚丙烯酰胺凝胶（TBE-PAGE）上电泳，凝胶经硝酸银染色后，进行密度扫描。

1．3统计学处理采用SPSS-7.5统计软件包进行统计学处理，所有资料均采用±s表示；多组资料间比较，采用One-WayANOVA分析，组间两两比较采用LSD法；对有相关趋势的变量采用Pearson相关分析。

2结果