摘要目的：观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对人肾成纤维细胞(KFB)的影响。方法：采用ELISA法、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞仪、免疫组织化学法分别检测AngⅡ对KFB分泌的胶原酶活性、KFB增生、凋亡、Ⅰ型胶原表达的影响。结果：AngⅡ能提高KFB分泌的总胶原酶活性、促进KFB增生、抑制KFB凋亡、促进KFB Ⅰ型胶原的表达。结论：AngⅡ能通过促进KFB增生、抑制KFB凋亡、促进KFB Ⅰ型胶原的表达来促进肾间质纤维化。

EFFECTSOFANGIOTENSINⅡONHUMANKIDNEYFIBROBLAST

FANQinQUShilinCHENGGaoxiang

（DivisionofNephrology，DepartmentofMedicine，theFirstUniversityHospital，WestChinaUniversityofMedicalScience，Chendu610041）

OBJECTIVETostudytheeffectsofangiotensingⅡonhumankidneyfibroblasts（KFB）initssecretedcollagenasesactivity，proliferation，apoptosisandexpressionoftypeⅠcollagen．METHODOLOGYTheactivityoftypeⅠcollagenase，KFBapoptosis，proliferationandcollagenⅠexpressionweredetectedbyELISA，flowcytometer，MTTandimmunohistochemicalmethodrespectively．RESULTSAngiotensinⅡenhancedtheactivityofcollagenasesecredtedbyKFB，inhibitedKFBsapoptosis，promotedtheKFBsproliferationandenhancedtheexpressionoftypeⅠcollageninKFB．CONCLUSIONAngiotensinⅡcaninducerenalfibrosisbyinhibitingapoptosis，promotingproliferationandexpressionoftypeⅠcollagenofKFB．

KeywordsangiotensinⅡfibroblastsapoptosis

肾间质纤维化是多种肾脏病发展至终末期肾功能衰竭的共同通路^［1］，因而及早阻止甚至逆转肾间质纤维化对防治终末期肾功能衰竭具有重大意义。研究表明，人肾成纤维细胞(KFB)是肾间质的主要重构细胞，在肾间质纤维化中起重要作用^［2］。肾间质纤维化的主要原因是KFB增生及细胞外基质(ECM)过度堆积。KFB增生与细胞增生活跃而凋亡减少有关；ECM堆积与ECM产生及分解失衡相关。近年的研究表明，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）不仅通过改变肾小球血流动力学促进肾小球硬化，还可通过发挥肾脏生长因子的作用促进系膜细胞（MsC）、血管平滑肌细胞、肾小管细胞增生及ECM堆积，并且AngⅡ的这些作用可能通过诱导细胞产生自分泌因子而介导^［3～6］。然而，却缺乏AngⅡ对人胚胎KFB影响的研究，因此，本实验首次研究了AngⅡ对人胚胎KFB的影响，以探索AngⅡ在肾间质纤维化中的作用。

1材料和方法

1．1药品和试剂MEM-F₁₂（GIBCO公司），鼠抗人Ⅰ型胶原单克隆抗体、人Ⅰ型胶原、胰蛋白酶抑制剂（SIGMA公司），亲和素生物素复合物（ABC）试剂盒（VECTOR公司），辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠Ⅱ抗（华美公司），二甲亚砜（MERCK公司），灭活新生小牛血清（四川洪雅力生生化厂），胰蛋白酶（DIFCO公司），青霉素、链霉素（华北制药厂），OPD（西安化学试剂厂），MTT（上海华顺生物试剂厂），多聚赖氨酸（中山公司）。

1．2方法

1．2．1KFB培养及鉴定KFB的培养：用无Ca^2＋、Mg^2＋的Hank’s液冲洗水囊引产的5月龄新鲜胎儿肾脏，小心剪去肾脏表面附着的结缔组织及肾皮质，再用无Ca^2＋、Mg^2＋的Hank’s液反复冲洗髓质组织，剪成1×1mm³的碎块，加入0.1％（w／v）胶原酶Ⅳ1ml消化组织，用200目细胞筛过滤消化液，收集滤液于离心管中，1000 r／min离心5min，然后用PBS洗涤三次，用DMEM-F12洗涤一次。洗涤后加入含20％灭活的新生小牛血清的DMEM-F12培养基，悬浮细胞，用台盼蓝染色计数，成活率为96％。将细胞悬液接种于75cm²培养瓶中（密度为2×10⁶／瓶），于37℃、5％CO₂孵箱中孵育。次日换液，待细胞生长为单层后，用0.25％的胰蛋白酶于室温消化3min后用含20％的小牛血清的DMEM-F12悬浮细胞行1∶2扩增传代。

KFB的鉴定：培养的细胞经相差显微镜、透射电镜及免疫学(细胞胞浆肌动蛋白、波形蛋白及Ⅰ型胶原染色阳性)鉴定证实为人胎KFB。

1．2．2AngⅡ对KFB表达Ⅰ型胶原酶活性的影响参照文献［7］的方法检测胶原酶的活性，并加以改进。

（1）将3～5代的KFB接种于24孔培养板中，每孔的接种密度为5×10⁷／L。在5%CO₂，37℃孵育24 h后，更换成无血清DMEM-F12培养液，继续培养24 h，然后将细胞分为4组：细胞培养板中AngⅡ的终浓度分别为10^－8mol／L、10^－7mol／L、10^－6mol／L、0 mol／L（对照）。每浓度时间点设3复孔。在第24、48及72 h检测培养板各孔胶原酶的活性。

（2）胶原酶活性的检测方法

包被胶原：将人Ⅰ型胶原溶解于0.4mol／L的醋酸中，配制成1 g／L的胶原溶液（pH 6.9），临用前将此溶液用PBS稀释至10 mg／L。酶标板中每孔均加入100 μl的胶原稀释液，于湿盒中4℃包被24 h，次日弃去酶标板中的液体，并用含0.5％（v／v）Tween-20浓度为0.01mol／L的PBS（pH 7.2）反复清洗酶标板三次。

封闭酶标板：酶标板中加入1％（w／v）的牛血清白蛋白（200 μl／孔），于37℃孵育1 h，再用PBS反复清洗酶标板。

检测样品：收集细胞培养板中的上清，加入用胶原包被的酶标板中，于湿盒中37℃孵育16 h，去除酶标板中的液体，用含0.5％（v／v）Tween-20浓度为0.01 mol／L的PBS（pH 7.2）反复清洗酶标板，然后酶标板中加入1％（w／v）的牛血清白蛋白（200 μl／孔），于37℃孵育1 h，再用PBS反复洗涤。酶标板中加入100 μl鼠抗人Ⅰ型胶原单克隆抗体（1∶2000），在37℃孵育2.5 h，用PBS反复清洗后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶500）100 μl，在37℃孵育1.5 h，PBS反复清洗后加入显色剂OPD，反应10 min后加入2mol／L的H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪于490 nm处测其A值。A值大小与酶活性呈反相关。

1．2．3AngⅡ对人KFB增生的影响参照文献［8］的方法检测KFB的增生。取处于对数生长期的细胞接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100 μl，密度为1×10⁸个／L，于37℃，5％CO₂孵箱中培养24h，弃上清，加入无血清的DMEM-F12培养基，每孔100 μl，培养24 h，弃上清。将细胞分为4组：细胞培养板中AngⅡ的终浓度分别为10^－8 mol／L、10^－7mol／L、10^－6 mol／L、0 mol／L（对照）。每浓度设三复孔。于37℃，5％的CO₂孵箱中培养，分别于培养结束前6h加入MTT10 μl／孔（5g／L）。于第24、48、72 h结束培养，每孔弃去上清，然后每孔加入二甲亚砜100 μl，于37℃空气浴振荡至甲NB56B结晶完全溶解。分别测定其A570 nm、A630 nm值。A570 nm～A630 nm即反映细胞的增生程度。

1．2．4AngⅡ对人KFB调亡的影响参照文献［8］的方法检测KFB的凋亡。细胞以10⁸／L接种于6孔细胞培养板中，在5％CO₂，37℃孵育24 h后，更换成无血清DMEM-F12培养液，继续培养24h，然后将细胞分为2组：细胞培养板中AngⅡ的终浓度为10^－6 mol／L及0 mol／L（对照）。37℃，5％的CO₂中分别孵育24、48 h后，用0.25％的胰蛋白酶于37℃消化细胞5 min，加入生理盐水洗涤，1000 r／min离心5 min，如此反复三次。取1×10⁶个细胞，用70％的酒精固定12 h，调细胞浓度为1×10⁸个／L，用碘化丙啶染色30 min，尼龙网过滤，流式细胞仪检测细胞凋亡的百分率。每例样品测定约5×10³个细胞。

1．2．5AngⅡ对人KFBⅠ型胶原表达的影响参照文献［8］的方法检测KFBⅠ型胶原的表达。将3～5代的细胞以10⁸／L接种于内置经多聚赖氨酸处理的盖玻片的六孔板中，在5％CO₂，37℃孵育24h后，更换成无血清DMEM-F12培养液，继续培养24 h，分为2组：细胞培养板中AngⅡ的终浓度为10^－6 mol／L及0 mol／L（对照）。48h后小心取出盖玻片，干燥后用甲醇固定30 min，用双蒸水冲洗后，加入1∶10的双氧水在室温下反应20 min，用PBS反复冲洗三次后用10％的牛血清白蛋白封闭10 min，再以PBS反复冲洗三次。分别加入1∶100稀释的Ⅰ型胶原单克隆抗体100 μl，4℃湿盒中孵育24 h后用PBS反复冲洗三次后，分别加入1∶100稀释的生物素标记的IgG100 μl，37℃湿盒中孵育1 h，用PBS反复冲洗；加入ABC复合物100 μl，37℃湿盒中孵育1 h；用PBS反复冲洗后加入显色剂DAB，反应10 min后以自来水终止反应。将切片做图像分析。

1．3统计学方法AngⅡ对人KFB分泌的Ⅰ型胶原酶活性、人KFB增生的影响用t检验；药物对人KFB凋亡的影响用χ²检验；药物对人KFB胶原表达的影响用医用图像分析仪相应的统计软件进行统计分析。

2结果