摘要目的：探讨成人原发性肾病综合征（NS）患者外周血单个核细胞（PBMC）中IL-13mRNA表达及IL-13血浆水平变化。方法：选择10名健康正常对照者和16名NS患者。采用反转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术，对NS患者PBMC中IL-13mRNA表达量进行分析。同时应用IL-13特异的酶联免疫吸附法（ELISA）测定IL-13血浆水平。结果：NS患者PBMC中IL-13 mRNA表达量及血浆IL-13水平均较正常对照组增高（IL-13 mRNA表达量为1.28±0.13vs0.45±0.12，P＜0.05；IL-13血浆水平为55.73±12.72vs28.51±8.36，P＜0.05）。蛋白尿伴肉眼血尿组NS患者的IL-13血浆水平较单纯蛋白尿组降低（68.91±4.34vs54.65±2.11，P＜0.05）。直线相关分析表明，IL-13血浆水平与NS患者蛋白尿和血尿程度呈负相关，r分别为－0.553和－0.708，P均小于0.05。结论：IL-13参与NS分子发病机制，IL-13蛋白质分泌水平相对下降，在NS患者肾小球硬化发生发展中可能起一定作用。

IL-13 GENE EXPRESSION IN PERIPHERAL bLOOD MONONUCLEAR CELLS ANDPLASMA IL 13 LEVELS IN ADULT PRIMARY NEPHROTIC sYNDROME．

Zhang Zhao，Chen Xiaowen，Jiang Liming，Wang jianxun，Wu Ping，Huang Pingping．

kidney Institute，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Guangdong，Zhanjiang，524001

OBJECTIVE To investigated the clinical significance of peripheral blood mononuclear cells（PBMC） IL13 gene expression and plasma IL-13 levels in patients with primary nephrotic syndrome（NS）．

METHODOLOGY 10 healthy volunteers and 16 patients with primary nS were included in this study．All patients underwent percutaneous renal biopsy with light microscopic and immunoflurecence microscopic examination．The expression of IL13 mRNA in PBMC was evaluated by reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）．The levels of plasma IL-13 were determined using an IL-13 specific enzyme-linked imunosorbent assay（ELISA）．

RESULTS The expression of IL-13 mRNA in PBMC and plasma levels of IL-13 in patients with primary NS were significantly higher than those of the healthy controls （1.28±0.13 vs 0.45＋0.12，P＜0.05，55.73±12.72 vs 28.51±8.36，P＜0.05）．Decreased levels of plasma IL-13 were found in NS patients with gross hematuria as compared to those with proteinuria（54.65±2.11 vs 68.91±4.34，P＜0.05）．Linear correlation analysis showed that levels of plasma IL-13 were negatively correlated with the levels of proteinuria and hematuria in NS （r＝－0.533，－0.708，respectively，P＜0.05）．

CONCLUSION IL-13 might be involved in molecular pathogenesis of primary nephrotic syndrome．Low plasma IL-13 level may play a role in the development of glomerulosclerosis in primary nephrotic syndrome．

Key words gene expression Interleukin-13 primary

nephrotic syndrome

白细胞介素-13（IL-13）是近年来受关注的一种抗炎性细胞因子。主要由活化Th2细胞分泌。其生物学效应主要是抑制单核／巨噬细胞的炎性细胞因子的产生，调节体内免疫功能。目前已证明致炎细胞因子参与肾病综合征（NS）发病，如IL-1、IL-6、IL-8及TNF等致炎因子的相互作用，刺激肾小球系膜细胞增生，细胞外基质合成增加、积聚，最终导致肾小球硬化。但作为抗炎性细胞因子IL-13在NS分子病理中起何种作用，国内外目前尚缺乏系统的研究资料。为此，我们应用ELISA法分析NS患者IL-13血浆水平，采用RT-PCR法检测NS患者外周血单个核细胞（PMBC）IL-13 mRNA表达量的变化。分析IL-13基因及蛋白质水平的改变，及其与NS的临床表现及肾脏病理类型的关系，为进一步研究NS的发病机制提供新的依据。

1对象和方法

1．1研究对象

1．1．1正常对照组10例（男5例，女5例）年龄为18～40（平均年龄29）岁，均为健康志愿者。

1．1．2原发性肾病综合征组16例（男8例，女8例）年龄为16～44(平均年龄30)岁。全部病例均行经皮肾穿刺活检，常规光镜、免疫荧光病理检查。肾活检前病程为20天～1年。全部病例尿蛋白均＞3.5 g／24h，血清白蛋白＜30 g／L，或伴有高脂血症及水肿。各项临床及生化项目检查均除外系统性红斑狼疮、紫癜性肾炎、糖尿病、肝硬化等继发性肾病综合征。肾脏病理类型分布：非IgA系膜增生性肾炎5例（其中4例为轻度增生，1例为中度增生）。局灶、节段性肾小球硬化（FSGS）5例，IgA肾病2例，膜性肾病3例（其中Ⅰ期2例，Ⅱ期1例），膜增生性肾小球肾炎（MPGM）Ⅰ型1例。全部NS患者肾功能正常，平均血清肌酐为80.02±17.69μmol／L。近期内无明显肺部感染或全身性感染，近2个月内未接受激素或免疫抑制剂治疗。

1．1．3病例分组NS组分为单纯蛋白尿组及血尿组。肾小球性血尿分肉眼血尿和镜下血尿。镜下血尿指尿红细胞大于5万／ml。

1．2实验方法

1．2．1标本采集收集晨空腹肝素抗凝血5ml（10 u／ml），分离血浆于－70℃保存待测。

1．2．2外周血单个核细胞的收集采用Ficoll密度梯度离心（3000r／min离心30min），获取外周血单个核细胞，细胞总量达1～5×10⁶个。

1．2．3细胞总RNA抽提采用GIBCOBRL公司的TRI_ZOLRNA提取试剂盒抽提RNA。严格按试剂盒说明书操作，制备的细胞总RNA用紫外分光光度计测定读数A260／A280＞1.8，同时经RNA甲醛变性电泳检测到28s和18sRNA两条带，其EB显色强度约为2∶1。调整RNA浓度为1μg／μl后即作RT-PCR反应。

1．2．4反转录多聚酶链反应（RT-PCR）及PCR产物半定量分析。

（1）参考人IL-13cDNA序列，进行特异性IL-13引物设计。引物1序列为5′GCT cTC ACTTGCCTTGGCGG3′，引物2序列为3′TTCTTTGAAAAAGCGCTCCC 5′。由北京赛百盛生物工程公司合成，OPC方法纯化，PCR扩增产物长度为359 bp。为准确地检测IL-13 mRNA表达水平，我们选用β-actinmRNA作为内参照^［1］。将每份标本cDNA与IL-13、β-actin两对引物置同一管内同时扩增，测量IL-13与β-actin特异扩增产物的产量，并计算IL-13 mRNA与β-actinmRNA的比值，即为IL-13 mRNA的相对表达水平。β-actin引物1序列为5′ATT cGL TGA CCA TCA ATA AG3′，引物2序列为5′GGC GTG ATG TAG TTG CTT gG3′，合成公司及纯化方法与IL-13引物相同，β-actinPCR扩增产物长度为260bp。

（2）cDNA第一链合成，反应体积为20μl。应用GIBCOBRL公司提供的superscript^TM preamplification system进行IL-13cDNA第一链合成。样品RNA1.0μg，六聚体随机引物在superscriptⅡRT逆转录酶作用下，42℃反应50min产生IL-13cDNA及β-actincDNA第一链。

（3）cDNA第二链合成体系，反应体积为50μl。分别加入人IL-13引物1和引物2各2μl及β-actin引物1及引物2各1μl，cDNA第一链反应物4μl，TaqDNA酶2U及合适的PCR反应缓冲液、dNTP等进行反应。PCR扩增条件：94℃1min，55℃1min，72℃1min，反应30个循环。扩增产物用约1.5％琼脂糖凝胶电泳，稳压电泳5V／cm约1.5h，0.5 mg／L溴乙锭染色20min后，紫外灯观察、拍照。在UVP凝胶成像系统分析系统中扫描，并分析电泳带灰度。以特异性IL-13扩增带灰度与同管扩增的β-actin扩增带灰度之比，表示IL-13 mRNA表达水平。

（4）PCR产物特异性的监控应用反转录试剂盒内对照RNA加入样品管内进行第一链合成，再进行PCR仪扩增30循环，PCR扩增产物同时出现523 bp扩增条带，证明无RNA酶污染。在反应中不加逆转录酶或人IL-13引物1或引物2，均不出现特异性的359 bp条带，以证明我们设计的引物是人IL-13 cDNA特异性引物，359 bp条带来源于人IL-13 mRNA而非GenomicDNA。

1．2．5ELISA法检测血浆IL-13分泌水平人IL-13 eLISA检测试剂盒购于Amershanlifescience公司，严格按照试剂盒说明书操作。将50μl样本血浆加入IL-13单抗包被孔中→加入已标记生物素的IL-13多抗→形成双夹心抗原抗体复合物→加入酶标的生物素抗体→加入酶的底物发生显色反应→酶标仪450 nm读吸光度。描绘不同稀释浓度IL-13标准品曲线，从不同浓度的标准品曲线上计算样品IL-13含量。

1．3统计方法数据以均数±标准差（±s）表示。组间差异采用t检验。两个变量间的相互关系应用直线相关分析。P＜0.05为统计学差异明显。

2结果

2．1NS组与正常对照组IL-13血浆水平及PBMC IL-13 mRNA表达量变化NS组较正常<