关键词： 重症肌无力；肌，骨骼；蛋白质类

【摘要】目的探讨重症肌无力（MG）肌肉中与收缩有关的肌球蛋白成分是否减少。方法 用Gubstraub溶液(myosin 提取液) 按常量（匀浆）和微量（浸出）方式提取10名正常人及17例MG患者肌肉的蛋白成分，用双盲法分别以常量及微量聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法分析肌肉蛋白成分, 用双向电泳分析有差异的谱带。结果常量SDS-PAGE电泳图谱分析显示,相对分子质量约25 000的蛋白谱带密度为4.14±1.33，MG患者肌肉为2.02±1.08，差异有非常显著意义（P＜0.001）；微量分析获得正常肌肉该蛋白谱带的密度为4.26±2.58，MG患者肌肉为1.34±0.79，差异亦有非常显著意义（P＜0.001）；双向电泳显示，有差异的25 000蛋白略偏碱性，并至少由2个等电点相近的蛋白成分组成。用部分纯化的肌球蛋白鉴定显示，25 000蛋白与肌球蛋白轻链无关。结论MG患者肌肉中25 000蛋白水平明显低于正常人肌肉，提示该蛋白可能与MG发病或发展有关。

Analysis of protein components of skeletal muscle from the patients with myasthenia gravis

REN Huimin, ZHOU Zhigang, CHEN Xiangjun, et al.

nstitute of Neurology, Medical Center of Fudan University, Shanghai 200040, China

【Abstract】ObjectiveTo explore whether the components of protein associated with muscle contraction appear decreased in the muscles of myasthenia gravis (MG).MethodsThe proteins were extracted from 10 normal cases and 17 cases of MG skeletal muscles with Gubstraub solution, and the components of the protein were analyzed by SDS-PAGE in common and micro methods in double blind. Composition of the differential protein band was observed by two-dimensional electrophoresis.ResultsSDS-PAGE patterns showed that the density of the protein band with a mass of about 25 kD in MG muscles was much lower than that in normal muscles. The value of density for 25 kD protein band in common analysis was 4.14±1.33 and 2.02±1.08 in the normal and MG muscles, respectively (P＜0.001), while in micro analysis the density of the protein band was 4.26±2.58 in normal and 1.34±0.79 in MG muscles, respectively (P＜0.001).The pattern of two-dimensional electrophoresis demonstrated that the differential 25 kD protein band was composed of more than two components appearing in the adjacent isoelectric point on the alkaline side of the gel, and they were proved to be not related to the components of myosin light chains. ConclusionIt was suggested that pathogenically the development of MG should be associated with the involvement of 25 kD protein of the skeletal muscles.

【Key words】Myasthenia gravis； Muscle, skeletal； Proteins

重症肌无力（MG）被认为是一种由乙酰胆碱受体（AChR）抗体引起神经肌肉接头突触膜AChR功能丧失的自身免疫疾病。但近年已发现，一系列的非AChR骨骼肌抗体^［1］、Ryanodine 受体抗体及补体C₉等均与MG的发病有关^［2］。最近，我们不仅从肌肉组织中筛选到5个在正常人和MG患者肌肉中表达有明显不同的新的基因片段^［3］，而且发现在以PBS提取的MG患者肌肉蛋白成分中，1个相对分子质量约25 000的蛋白的水平明显低于正常人肌肉。由于AChR 抗体阳性和阴性的MG患者临床表现相似，均为骨骼肌极易疲劳，并且已经知道Duchenne和强直性等肌营养不良的肌病患者骨骼肌肌球蛋白轻链组成发生了改变^［4］，那么，是否MG患者肌肉极易疲劳的唯一原因为AChR功能的丧失， 而不涉及肌肉蛋白，特别是与收缩有关的蛋白的变化呢？本研究就此问题进行探讨。

资料和方法

1． 样品来源：正常人肌肉标本10份，取于10例骨折手术病人的肢体骨骼肌。MG患者肌肉标本17份，取于17例全身型MG患者，无呼吸肌受累，其中8例伴胸腺瘤，9例伴胸腺增生。肌肉取自MG患者胸腺切除手术切口周围的骨骼肌，标本均于-27℃保存。

2． 蛋白的提取及浓度的测定：蛋白按常量及微量两种方法进行提取。常量提取：肌肉样品取米粒大小置微量玻璃匀浆器，加入100 μl肌球蛋白提取液Gubstraub溶液(0.3 mol/L KCl，0.10 mol/L KH₂PO₄，0.05 mol/L K₂HPO₄,pH 6.5)，冰浴下制成匀浆，吸出肌肉匀浆，加50 μl提取液洗涤，合并匀浆液并放置4℃过夜，10 000×g离心15 min，上清液再经25 000×g离心10 min，按Spector^［5］方法测定蛋白浓度。微量提取：将低温贮存的肌肉标本移至4℃冰箱，放置片刻使其软化，取一小块肌肉置解剖镜下滴加含20％甘油的生理盐水，剥取肌纤维10根左右，放置0.5 ml Ep管底部，加入10 μl Gubstraub溶液，4℃过夜，离心后吸取上清液，蛋白定量后冷冻保存。

3． 肌球蛋白的部分纯化：基本按Konagaya等^［6］方法进行。简言之，取正常人与MG患者肌肉各1块（约10 mm³），按上述常量提取法获得蛋白上清液， 该上清液以14倍体积的预冷无离子水稀释，混匀后10 000×g离心 10 min，沉淀用100 μl Gubstraub溶液溶解，再以9倍体积的预冷无离子水稀释，混匀后10 000×g离心10 min，沉淀用50 μl Gubstraub 溶液溶解。

4． 蛋白的单相电泳分析：基本按Laemmli^［7］ 方法进行非连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。制胶及电泳缓冲液均为含 0.1％SDS的Tris/Gly, pH 8.3。常量电泳分析蛋白加样量均为30 μg,凝胶用考马斯亮蓝染色。微量电泳分析加样量均为1 μg, 蛋白检测基本按Kirkeby等^［8］方法进行银染。

5． 蛋白双向电泳分析：基本按任惠民等^［9］方法进行。第1向等电聚焦的胶长约40 mm，直径0.7 mm，凝胶浓度为5％（含4％ pH 3.5～10.0的ampholyte, 5%甘油和1％尿素）。蛋白加样量为30 μg，凝胶上蛋白用银染显色。

6． 蛋白分析及统计方法：将所需比较的蛋白谱带经生物电泳图像分析仪扫描并计算密度。检测结果以±s表示，两组间比较采用t检验。

结果

1． 肌肉蛋白的微量和常量分析电泳图谱：图1左侧为常量提取的肌肉蛋白电泳图谱，图1右侧为微量提取的肌纤维蛋白经电泳分离的银染图谱。2种方法分析的结果均显示，相对分子质量约25 000蛋白谱带浓度在正常肌肉中明显高于MG肌肉。

左： 常量蛋白电泳分析； 右： 微量蛋白电泳分析

2、7、8： 正常肌肉; 1、3、4、5、6、9、10： MG肌肉

图1正常及MG 肌肉蛋白的SDS-PAGE 分析

2． 正常人肌肉与MG患者肌肉25 000蛋白水平的比较：常量电泳分析，25 000蛋白谱带经扫描计算，密度在正常肌肉中为4.14±1.33， MG肌肉中为2.02±1.08, 差异有非常显著意义(P＜0.001)。微量电泳分析，25 000蛋白谱带密度在正常肌肉中为4.26±2.58, MG肌肉中为1.32±0.79,差异亦有非常显著意义(P＜0.001)。

3． 蛋白的双向电泳图谱：图2A为正常人及MG患者肌肉蛋白的双向电泳图谱。从图2A可看出单相SDS-PAGE图谱所显示的25 000谱带至少由2个蛋白成分组成，正常肌肉与MG肌肉中有明显差异的是1个偏碱的蛋白成分。图2B为提取的肌肉蛋白与部分纯化的肌球蛋白提取物双向电泳图谱。可以看出，有差异的25 000蛋白与肌球蛋白提取物获得的蛋白成分无关。

讨论

人们很早就对MG患者肌肉的形态学特征及与肌肉收缩有关的重要化学物质，如肌球蛋白、肌动蛋白等进行了研究。虽然发现MG患者血清中抗肌球蛋白、肌动蛋白、肌钙蛋白等抗体滴度高于健康人^［10］, 但迄今仍没有充分的证据说明MG患者肌细胞中调控肌纤维收缩的粗丝、细丝和Z带等形态学特征以及与肌肉收缩有关的蛋白合成发生了明显的改变，即使是在MG患者胸腺组织，也未发现肌样细胞(myoid cells)的数目和结构以及对肌球蛋白、肌钙蛋白等抗体的染色反应与正常人有明显的差别^［11］。因此，目前对MG的研究主要集中在对AChR的结构、抗体与抗原免疫学特征、应答AChR功能丧失的免疫学机制等方面。那么，MG患者肌细胞内的化学物质，特别是DNA与蛋白是否真的没有发生改变呢？答案是否定的。

A. 正常人及MG患者肌肉蛋白的双向电泳图谱

左：正常人肌肉； 右： MG患者肌肉； 中：标准相对分子质量蛋白

Ac: 肌动蛋白； Tp: 肌钙蛋白； MLC：肌球蛋白轻链；

IEF：等电聚焦；SDS-PAG