关键词： 巨细胞病毒感染；大脑皮质；钙调蛋白；RNA，信使

【摘要】目的研究先天性人巨细胞病毒（HCMV）感染致脑损害后钙调素(CaM)基因mRNA的改变，探讨先天性HCMV感染所致脑损害的机制。方法选用10周龄Balb/c小鼠32只，雌雄配对合笼，合笼前雌雄鼠腹腔内均注射HCMV，分为1.00 ml、 0.50 ml和0.25 ml各4笼，同时设4笼作为正常对照组（腹腔内注射1.0 ml RPMI 1640培养液）。剖腹取21 d胎鼠大脑皮质，分别用逆转录聚合酶链反应技术检测CaM mRNA的相对含量，用原位杂交方法检测大脑皮质细胞内相应mRNA及其定位。结果DNA浓度测定结果表明，1.00 ml组与0.50 ml组胎鼠逆转录聚合酶链反应产物相对浓度明显高于0.25 ml组及对照组， 前两组比较亦有明显差异。凝胶电泳结果显示，对照组与0.25 ml组胎鼠未见阳性条带，而1.00 ml组胎鼠特异性条带信号强于0.50 ml胎鼠组，仅略低于同组母鼠。原位杂交结果显示，CaM mRNA 不但出现在1.00 ml组胎鼠大脑皮质大神经元胞核及胞质内，在中、小神经元及胶质细胞的胞核及胞质亦有高密度表达，阳性细胞的突起中亦有弱信号存在。结论先天性HCMV感染胎鼠大脑皮质内CaM mRNA表达量明显增加，神经元及胶质细胞均有表达，并与感染的病毒剂量有关。

Changes of calmodulin mRNA in the cerebral cortex of fetalmice infected congenitally by human cytomegalovirus

CHEN GuihaiWANG Mingli, YUAN Zhongyu

Department of Pathogenic Biology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China

【Abstract】ObjectiveTo obtain the evidence of the changes of calmodulin gene expression in the brain of congenital infection by human cytomegalovirus (HCMV).Methods32 Balb/c mice aged 10 weeks were chosen. The model of congenital central nervous system infection was established by injecting abdominally 1.00 ml, 0.50 ml, 0.25 ml HCMV into female and male mice respectively, then the mice were matched in a cage. The controls were injected abdominally with 1.00 ml RPMI 1640 Medium. The cerebral cortexes, which were collected the 21 days fetal mice removed from the uteri, were studied using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ hybridization histochemistry. The relative concentrations of RT-PCR products were calculated by their value of OD₂₆₀ detected with type UV-754 spectroradiometer, and the gel electrophoresis was done for them.ResultsThe concentrations of RT-PCR products derived from 1.00 ml and 0.50 ml groups were markedly higher than those in 0.25 ml group and control group, however there was obvious difference in between 1.00 ml and 0.50 ml group. The electrophoresis showed that there were not any positive bands in 0.25 ml group and the controls, whereas the signal of specific positive bands in 1.00 ml group was stronger than that in 0.50 ml group and slightly weaker than that in the mother group. In situ hybridization demonstrated that the higher density of calmodulin mRNA positive signals existed not only in the cytoplasm and nucleus of large neurons but also in the cytoplasm and nucleus of moderate or small neurons and gliocytes of cerebral cortex in 1.00 ml fetal mice, and that the cell processes were weakly stained. There were no obviousy positive signals in 0.50 ml, 0.25 ml group, and control group and in 1.00 ml negative control group without probes, respectively. ConclusionCongenital HCMV infection resulted in marked mRNA increase of calmodulin gene in cerebral cortex of fetal mice, which showed the positive association between various titers and gene expression, and the over-expression of calmodulin mRNA existed in not neurons and also in gliocytes.

【Key words】Cytomegalovirus infection; Cerebral cortex; Calmodulin； RNA, messenger

人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是疱疹病毒β亚科病毒。尽管孕妇通常呈隐性感染，但HCMV能通过胎盘传播给胎儿，是病毒性宫内感染的最常见原因^［1］，可对胎儿产生严重后果，导致流产、死胎及新生儿巨细胞包涵体病。明显的中枢神经系统缺陷症状是受感染后出生婴儿的常见表现。但迄今为止，对HCMV先天性感染导致中枢神经系统损害的机制尚不清楚。

钙作为细胞内第二信使有广泛的生物学功能，成为多种细胞信息传递途径的枢纽^［2］。Ca²⁺通过与钙调素（calmodulin, CaM）结合成活化的Ca²⁺-CaM复合物，对多种酶和蛋白起作用，调节着大量的细胞活动，成为Ca²⁺信使分子作用的主要途径。Ca²⁺-CaM系统及CaM基因的表达与中枢神经系统的生理活动、生长发育、组织分化及病理过程关系密切^［3-5］。

HCMV所致脑炎有广泛脑组织钙化的病理改变^［6］，表明HCMV感染中枢神经系统时伴有钙系统紊乱。HCMV感染其他细胞可引起受感染细胞钙内流明显增加，且内流的速度与病毒感染复数及感染后的时间有关^［7］。我们在建立小鼠先天性感染HCMV模型的基础上，对脑细胞内控制与Ca²⁺作用功能相连的CaM的基因表达进行了探讨。现将结果报道如下。

材料和方法

一、主要试剂

所用主要化学及分子生物学试剂分别由Promega公司、Sigma公司、Beohringer Mannheim公司和华美生物工程公司提供。

二、HCMV先天性感染胎鼠模型的建立

1.病毒：将液氮中冻存的HCMV AD169在人成纤维细胞上传7～8代以增强毒力。按Gibson^［8］的终点稀释法，以在24 h出现病毒致细胞病变效应达（+++～++++）的病毒悬液，在人成纤维细胞上滴定半数组织培养感染剂量（TCID₅₀），以6.0 log TCID₅₀/ml的病毒作为实验用毒种。

2.模型制作：健康Balb/c小鼠（SPF级，10周龄，体重25 g左右），雌雄鼠共32只，按一雌一雄随机配对分笼，雌雄鼠腹腔内均注射等剂量HCMV悬液，其中1.00 ml 组、0.50 ml组及0.25 ml组各4笼，同时设4笼对照（腹腔内注射1.00 ml RPMI 1640培养液）。模型制成后饲养于本室专用感染动物橱内，次日晨起，以涂片染色法连续检测母鼠阴道内精子，以判定受孕时间。受孕21 d时剖腹取胎鼠。

3.病理学检查：取胎鼠及母鼠大脑皮质组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，苏木素-伊红染色，光镜观察。

4.病毒分离：无菌操作下取胎鼠双侧大脑皮质，用细胞维持液10倍稀释，制备成脑细胞悬液，低速（4 000 r/min）离心，取上清：（1）直接接种0.2 ml至人成纤维细胞单层上；（2）经56℃ 30 min灭活后再接种，对照者接种正常胎鼠脑组织细胞悬液上清，37℃吸附1 h，加维持液。置37℃培养（湿度100%，5%二氧化碳），3～4 d换液1次，连续观察细胞病变效应1～8周。如培养4周仍未出现细胞病变效应则盲传3次，仍无细胞病变效应者为阴性。出现HCMV特征的细胞病变效应者， 取单层细胞用聚合酶链反应(PCR)检测HCMV-DNA。

三、 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 检测胎鼠大脑皮质CaM mRNA

1.引物的设计与合成:按照已认同的设计原则^［9］， 在小鼠脑CaM基因I cDNA序列^［3］中，选取CaM mRNA编码区域序列设计引物，由中国科学院上海植物生理研究所植物分子遗传国家重点实验室用DNA合成仪固相亚磷酸三酯法合成并纯化。序列分别为：上游引物5′CTGACTGAAGAACAGATTGC- TG3′(60～81位)，下游引物5′CTTCATAGTTGACCT- GTCCGTC3′(447～468位)，终产物长度为387 bp。内对照β-珠蛋白DNA引物序列参见Dieffenbach等^［9］方法，终产物长度为268 bp。

2.总RNA的提取: 取100 mg脑组织，按RT-PCR RNA一步样品处理试剂盒进行总RNA的提取，得到的RNA沉淀用盐酸三羟基甲烷乙二胺四乙酸缓冲液（pH 8.0）20 μl重悬，-20℃保存备用。

3.反转录: 按RT-PCR酶混合物试剂盒进行。CaM mRNA下游引物浓度为0.3 mol/L，总RNA 10 μl，所得到的cDNA直接进行下一步PCR扩增。

4.PCR: 参照Dieffenbach等^［9］的方法，在反应体系中加入CaM cDNA模板与相应上下游引物，并加内标模板及相应上下游引物。94℃预变性5 min，然后94℃ 45 s、55℃ 45 s和72℃ 1 min，共35个周期，72℃延伸7 min，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，同时用UV-754紫外分光光度计测定260 nm处的吸光度，计算DNA浓度（g/L)。

四、原位杂交检测胎鼠大脑皮质CaM mRNA

探针序列为5′CTCGTTGATCATATCCTGCAGTTC- AGCCTCTG3′(181～212位)，余同RT-PCR。冰上无菌下取胎鼠及其母鼠脑组织，在预涂粘附剂并经180℃干烤30<