关键词： 夏科-马里病；基因复制

【摘要】目的探索适合临床应用的检测腓骨肌萎缩症1A型（CMT1A）基因重复的有效方法。方法联合应用多聚酶链反应（PCR）加双酶切方法和短串联重复序列（STR）分析检测CMT病人17 p 11.2～12上的基因重复。共检测30 例无亲缘关系的CMT1病人和10例无亲缘关系的CMT2病人及40例对照。结果PCR-双酶切法的基因重复检出率为46.7%（14/30）；STR分析的基因重复检出率为53.3%（16/30）；联合应用上述两种方法的基因重复检出率为70.0%(21/30)。10例无亲缘关系的CMT2病人和40例对照组中，两种方法均未发现重复。结论PCR-双酶切法检测CMT1A基因重复敏感、快速、准确，适于临床推广应用；联合应用PCR-双酶切+STR分析，可提高CMT1A基因重复检出率。

Detection of duplication in Charcot-Marie-Tooth disease type 1A

DA Yuwei， SHEN Dingguo.

Division of Neuromuscular Disorders Research, The General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853, China

【Abstract】ObjectiveTo study the routine methods that can be easily used in clinics to detect the Charcot-Marie-Tooth (CMT) disease gene duplication.MethodPolymerase chain reaction(PCR) combined with restriction enzyme digestion and amplification of short tandem repeat (STR) sequence were used to detect gene duplication on chromosome 17p11.2～12 in 30 CMT1 patients and 10 CMT2 patients coming from unrelated families. 40 controls were also detected.Results46.7%(14/30) of CMT1 patients were identified to have specific junction fragments. 53.3%（16/30）of them were identified as duplication by STR analysis. 70.0%(21/30) of CMT1 patients were identified to have gene duplication using both methods. Duplication was not identified in 10 unrelated CMT2 patients and 40 controls.ConclusionThe PCR combined with restriction enzyme digestion represented a relatively sensitive and accurate method for detecting gene duplication in CMT1A cases for clinical diagnosis. The detecting rate of duplication can be increased using both restriction enzyme digestion of PCR products and STR methods.

【Key words】Charcot-Marie disease; Gene duplication

腓骨肌萎缩症1A型(CMT1A)是常染色体显性遗传病,其基因突变形式主要为17p11.2～12的1.5 Mb基因重复,两翼有长约30 kb的低拷贝重复序列称REPs^［1，2］。70%以上的无亲缘关系的CMT1家系及90%的散发病人都与1.5 Mb基因重复相关。已经证实,CMT1A重复是17号同源染色体在减数分裂期发生不等位互换产生的^［3,4］。当前诊断CMT1A重复的方法已有几种，其中脉冲场凝胶电泳结合DNA印迹法剂量分析是诊断率最高的一种方法，但此方法相当费时费力，要求很高的技术操作。STR方法虽易于在一般实验室推广，但受杂合率的限制。其他方法亦受各种因素的限制，很难在临床推广。因此有必要建立一种快速、简便、诊断率高的方法应用于临床。最近,已将CMT1A的交换热点确定在30 kb的CMT1-REP上1.7 kb的区域，且75%以上的CMT1A病人交换断点位于该区域^［5］。通过检测特异性融合片段,可简化诊断CMT1A。

资料和方法

一、 资料

1．病人组：CMT1病人30例，来自30个家系，为1995年10月至1999年2月我院门诊病人。其中男性21名，女性9名，年龄2～67岁。 CMT1病例选择参考Dyck1993年诊断标准^［6］：（1）有慢性进行性双下肢远端无力及肌萎缩，可伴有双上肢受累。（2）查体有周围神经损害表现，跟腱反射消失，下肢深感觉减退。（3）肌电图示运动神经传导速度明显减低，正中神经传导速度＜38 m/s。（4）排除吉兰-巴雷综合征及其他因素导致的周围神经病。（5）有家族史支持诊断。（6）神经活检示有髓纤维数量减少，有髓鞘脱失，Schwann细胞节段性再生，绕轴突形成同心圆样的“洋葱球”结构，可以确诊。

2．对照组:（1）CMT2病人10例，来自10个无亲缘关系的家系。 （2）其他神经肌肉病病人20例及健康对照20名。

二、方法

1．DNA提取：取病人外周血5 ml，2% EDTA抗凝，常规方法提取DNA，DNA溶于10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA溶液中（pH 7.5）保存。引物序列根据文献［7］：

distF: 5′GCTCAATTTTGGTGTTTAAATCAG 3′

proxR: 5′ATCCTCTAGTTACCCCTTTATTT 3′

结果

1. PCR-双酶切法对特异性融合片段（基因重复）检测与STR法基因重复的检测结果: 30例临床诊断为CMT1的病人用PCR-双酶切法检出基因重复14例，占 46.7%（图1）。STR法检出基因重复16例，占53.3%。联合应用两种方法共检出重复21例，占70.0%。其中7例未检测到特异性连接片段，用STR法发现重复；5例经STR 方法检测无重复的病人，用PCR-双酶切方法检测出重复。

2. 21名基因重复者中，有家族史者11例，重复者8例，占72.7%；散发者19例，基因重复者13例，占68.4%。

3. 30例CMT1病人，联合应用STR+PCR-双酶切法共检出重复21例，其中14例可检出特异性连接片段，占70.0%。

4. 10例CMT2病人、其他神经肌肉病对照和正常对照组中均未检测到重复。

1.PCR标记物；2. 有重复的CMT1 病人；3.无重复的CMT1病人；4.PCR产物；5.对照组病人

图1CMT1病人及对照组PCR产物和酶切结

讨论

近来，已将CMT1A 病人的交换热点区缩小至1.7 kb的区域内^［5］。PCR-双酶切方法的原理是：大多数CMT病人的重组断点位于远端CMT1-REP特有的EcoRI位点和近端REP特有的NsiI位点之间。在CMT1病人，重组产生一个特异性融合片断，即5′端来自远端REP，而3′端来自近端REP，侧翼是上面提及的特有的限制性酶切位点。为区分PCR扩增，引物的选择分别为远端和近端REP所特有的序列，位于1.7 kb热点区的两侧。因此,这对引物应能特异性扩增CMT1中基因重复者特有的2 185 bp杂合片段。但所期望的PCR产物片段也可在未发生重组的病人和对照组中出现（图1）。因两侧的REP具有高度的同源性,引物相关序列仅差1～3个碱基^［5］。 用EcoRI 和NsiI消化后可获得CMT1A特异性融合片段1 760 bp。即来自CMT1A病人的标本且交换热点位于1.7 kb区域者，应产生特异性CMT1A融合片段，而来自对照组的标本或重组发生于热点区以外者，就不应有该片段。

我们共检测30例经临床、电生理和病理确诊为CMT1的病人，其中14例检测到特异性融合片段，占46.7%。而用STR方法共检出重复16例，占53.3%。5例经STR 方法诊断无重复的病人，用PCR-酶切法检测出重复，这是受其杂和率的限制。7例经STR方法检测出重复CMT1病人，PCR-酶切方法未检测出特异性融合片段，这是因为其交换断点不在1.7 kb的区域内，而可能位于30 kb REP区的任何位置。联合应用这两种方法可避开各自的弱点，将基因重复检出率提高至70.0%。

21名基因重复者中，有家族史者的基因重复检出率为72.7%，与文献报道一致^［9,10］；而散发者基因重复检出率为68.4%，与文献报道不太一致^［9,11］，说明本组CMT1病人中散发者基因突变的特点可能与国外有所不同。

联合应用STR+PCR-双酶切法共检出重复21例，其中14例可检出特异性杂合片段，占70.0%，说明本组CMT1A病人中基因重组交换的热点亦位于1.7 kb区域内，与Haupt等^［7］的结果相似。此外，10例CMT2病人和40例对照组中未检测到特异性片段，说明PCR-双酶切方法无假阳性结果，诊断特异性高。

PCR-双酶切检测CMT1特异性融合片段的方法快速、简洁、特异性好，且不需特殊仪器，适用于常规诊断，可在临床推广应用。用此方法未检测到重复的病人可进一步应用STR方法，以提高检出率。

通信作者：笪宇威，100700北京军区总医院干部病房神经科

参考文献

1，Lupski JR, Oca-Luna RM, Slaugenhaupt S, et al. DNA duplication associated with Charcot-Marie-Tooth disease Type 1A.Cell, 1991,66:219-232.

2，Pentao L, Wise CA, Chinault AC, et al. Charcot-Marie-Tooth Type 1A duplication appears to arise from recombination at repeat sequences flanking the 1.5Mb monomer unit. Nat Genet, 1992,12:292-300.

3，Wise CA, Garcia CA, Davis SN, et al. Molecular analyses of unrelated Charcot-Marie-Tooth(CMT)disease patients suggest a high frequency of the CMT1A duplication. Am J Hum Genet