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摘要：目的筛选并鉴定与重症肌无力（MG）相关的基因。方法采用差别显示聚合酶链反应（DDPCR）从非肌病患者和MG患者骨骼肌组织中筛选出差异片段，并对其中1条片段进行鉴定和差异分析。结果通过比较1例非肌病患者和1例MG合并胸腺瘤患者骨骼肌组织中 mRNA表达，发现了25条差异片段，其中有12条来自MG患者，13条来自非肌病患者。选择1条来自于MG患者的cDNA片段测序，并做同源性分析发现：它是一个新基因片段,该基因被命名为P10。半定量的RT-PCR 证实：目的基因在MG患者胸腺和肌肉组织中表达上调；非肌病患者肌肉中表达低，而胸腺中则无表达。结论基因片段P10可能为重症肌无力的相关基因。
The expression of P10 mRNA in the muscles and thymus tissue of MG patient
ZHOU ZhigangWU YongqinREN Huiminet al.
（Institue of Neurology, Shanghai Medical University, Shanghai 200040, China）
Abstract：ObjectiveTo identify and analyze the gene expression of myasthenia gravis （MG）.MethodsDifferential expressional bands of skeletal muscles of both a control patient without involving muscles and a MG patient were screened by differential display polymerase chain reaction (DDPCR). One of the differential expressional bands was identified and analyzed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsThere were 25 differential bands. Thirteen bands were presented in the normal muscle tissue and the others were in the MG muscle. A band of the MG muscle was selected to compare with the known sequence of the GeneBank and EMBL DNA database. No known gene with significant homology to it was found. This band was named as P10. The expression of P10 mRNA of the muscle and the thymus was observed by RT-PCR showing that its mRNA was upregulated both in the muscle and the thymus from the MG patient. No P10 mRNA was expressed in the control thymus.ConclusionThe gene P10 found by DDPCR may be related to the pathogenesis of MG.
Keywords：Myasthenia gravis; Genes; Polymerase Chain Reaction▲
重症肌无力（MG）主要是由乙酰胆碱受体抗体（AChRAb）介导的，针对神经肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体(AChR)的自身免疫性疾病。85％以上的患者血清中可检测到AChRAb，大部分患者伴有胸腺增生或胸腺瘤［1-4］。多年来，人们对MG发病机制进行了大量研究，充分肯定了免疫机制在MG发病过程中的重要作用。另外，还发现MG发病具有一定的遗传倾向性和易患性，并且它们与HLA表型、AChR α亚单位基因、免疫球蛋白重链基因和T细胞受体基因有关［5-7］。但是,MG病因学中仍有许多现象不能用免疫机制来解释。例如：为何5％～15％患者血清抗体始终阴性，但临床特征却与抗体阳性MG 相似； MG 受多基因调控，但哪一种基因占主导地位尚未明确。因此，揭示MG致病基因的结构、突变情况和基因表达产物等遗传基础对了解MG发病原因是十分重要的。我们运用差别显示聚合酶链反应(DDPCR)技术比较了非肌病患者骨骼肌和MG患者骨骼肌mRNA的表达，筛选出与MG相关的基因，在原来基础［8］上报道P10基因的差异分布。
资料和方法
1．分组及组织总RNA的提取： 依据取材的部位及MG 患者是否伴胸腺瘤和胸腺增生而分为6组。 A组：非肌病患者肌肉，n=10(n代表该例患者所取标本数)。B组： 非肌病患者胸腺，n=7。C组：伴胸腺增生MG患者肌肉，n=12。D组：伴胸腺增生MG患者胸腺，n=13。E组：伴胸腺瘤MG患者肌肉，n=9。F组：伴胸腺瘤MG患者胸腺，n=9。取材后，标本用液氮速冻，参照TRIZol (GIBCOBRL) 试剂说明，提取组织总RNA，RNA经电泳定性并由紫外分光光度仪定量后冻存于-80℃。
2．DDPCR： 选1例MG患者和1例非肌病患者，各取1 μg骨骼肌组织总RNA作为mRNA差异显示的模板，分别以T12NA、T12NG、T12NC和T12NT（N代表dG、dC、dA或dT）为反义引物，用Super ScriptⅡ逆转录酶（GIBCOBRL）将RNA反转录成cDNA。然后用5个5′端随机引物分别与上述3′端引物配对，共组成20 对引物，进行PCR扩增。这部分工作已由本实验室武勇琴等［8］完成。
3．测序及同源性分析： 选择1条来自于患者肌肉组织的差异片段P10(暂命名)。用改良碱法抽提其质粒DNA，然后以此为模板，用Sanger双脱氧终止法测定其序列，将测得P10序列与GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB库中的已知序列进行同源性比较。
4．P10 mRNA在非肌病患者和MG患者中的表达：我们采用半定量RT-PCR检测P10 mRNA在MG 及非肌病患者的肌肉和胸腺组织中的表达，比较它们的差异。
RT：取0.4 μg RNA,加入1 μl Oligo dT(50 pmol/μl)；4 μl MgSO4(25 mmol/μl); 1 μl dNTP (各10 mmol/μl); 0.5 μl RNase抑制剂(40 U/μl)；1.0 μl BcaBest聚合酶(22 U/μl)； 2.1 μl无RNase去离子水；10 μl 2×Buffer（上述试剂均购自TakaRa公司），混匀后置于下列温度下反应：65℃ 1 min；30℃ 5 min；65℃ 30 min; 98℃ 5 min; 5℃ 5 min。
PCR: (1)引物设计：依照P10 cDNA序列，使用Oligo 5.0软件设计引物。上游引物:5′-GCTTGTA- GTGGTCGAGGATG-3′; 下游引物：5′-CCGCCCTT- TATCACTGGTG-3′。P10产物为514 bP。(2)反应条件：在RT产物中依次加入6 μl MgSO4(25 mmol/μl); 16 μl 5×Buffer; 0.5 μl Bca-Optimized Taq(5 U /μl);上下游引物(50 pmol/μl)各1 μl（均购自于TaKaRa公司），用无RNase的去离子水调至100 μl。(3)执行程序：94℃ 30 s；58℃ 1 min；72℃ 3 min; 进行33个循环后，72℃延伸7 min。
5．内参照和阴性对照： 以β-actin作为内参照，根据其序列设计引物：上游为5′-CCTCTATGCC- AACACAGTGC-3′，下游为5′-GTACTCCTGCTTGCTG- ATCC-3′。产物长度为211 bp。
阴性对照的设立:不做逆转录,直接做PCR扩增。内参照和阴性对照组实验条件同上述RT-PCR的反应条件。
6．数据统计：将实验组和内参照组的RT-PCR产物在2.5％琼脂糖凝胶上电泳，对电泳结果进行图像分析（Pharmacia Biotech 的imagemaster ID图像分析仪），记录每个条带的吸光度值，最后将实验组吸光度值与之相对应的内参照组吸光度相比，以此比值的百分比来作统计处理。所测数据采用SPSS/PC+软件包在计算机上分析，统计方法为计量资料多样本均数间两两比较。
结果
一、 mRNA差异显示
通过比较非肌病患者骨骼肌和MG患者骨骼肌mRNA的表达，获得了25条差异片段，其中有13条来自非肌病患者，12条来自于患者，这些片段长约200～700 bp。
二、 P10测序及同源性分析
选择1条来自患者肌组织的差异片段P10，分别用T7和SP6引物进行序列测定，部分序列如下：
CCGCGTGGATGCTTGTAGTGGTCGAGGATGATCTCTT-GGTACAGCCCGTTGAGGTCCACTTAGTTCACCCCGAA-AAATTCT
TGAGCGGCAACGATTCCCGACACTGCGGCA-TCGATGTCACTACGGTCGTTGTAGATGTA
从测序结果可知P10片段长599 bp,与mRNA差别显示的片段相近，此片段序列有5′端随机引物，序列引物为AGGGGTCTTG。将此序列与GeneBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB库中的已知序列进行同源性比较，发现与它有同源性的序列长度只有它自身长度的3.17％，说明P10代表的基因为新基因。
三、P10 mRNA在骨骼肌和胸腺组织中的表达（图1、2）
1.P10 mRNA在骨骼肌组织中的表达：P10 mRNA在非肌病患者骨骼肌中表达水平低于伴胸腺瘤MG患者，伴胸腺增生MG患者和伴胸腺瘤MG患者均有表达，但前者表达水平高于后者。
2. P10 mRNA在胸腺组织中的表达：非肌病患者胸腺中无P10 mRNA表达，而 P10 mRNA在伴胸腺增生MG患者的表达高于伴胸腺瘤MG患者。
上述比较经统计学分析,差异均有显著意义（P＜0.05），由于P10 mRNA在MG患者和非肌病患者的肌肉中均有表达,且表达有差异性，这样便排除了个体差异和DDPCR产生假阳性的可能,同时又可说明P10与MG有相对特异性。
上图：P10；下图：β-actin
1.PCR标记物； 2.阴性对照；3.MG伴胸腺增生者肌肉；4.MG伴胸腺瘤者肌肉； 5.非肌病患者肌肉；6.MG伴胸腺增生者胸腺； 7.MG伴胸腺瘤者胸腺； 8.非肌病患者胸腺
1P10 mRNA和其内参照在人胸腺和肌肉组织中的表达
