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摘要：目的通过研究细胞骨架的变化，探讨脑梗死后神经元及暗神经元损伤的程度。方法7例尸检梗死脑做全脑大切片染色后，将梗死及其周围分成4个区(0～3区)，各区取小块组织，用组织化学和免疫组织化学的方法观察梗死脑的暗神经元、微管相关蛋白（MAP2）、相对分子质量为200 000的神经丝（NF200）和星形细胞中的胶质纤维酸性蛋白（GFAP），认识暗神经元、细胞骨架与梗死病理过程之间的关系，并进行病灶内外及其与对侧脑组织细胞骨架变化的对比。结果1区暗神经元约为90%；2区为40%～50%，有些暗细胞伴有细胞骨架的严重变化，有的细胞骨架显色正常，少数FAS染色阳性，末端脱氧核苷酸转移酶介导DUPT的缺口末端描记法（TUNEL法）全部阴性。0区MAP2和NF200消失，1区MAP2和NF200显著异常，提示为不可逆的缺血损伤；2区MAP2和NF200有轻度改变，提示损伤可能为可逆性；3区细胞骨架正常而星形细胞增生明显，表明为损伤反应。结论暗神经元是脑缺血后的主要神经元变化形式之一，少数处于凋亡早期，多数则尚未凋亡。缺血细胞骨架损伤轻者，神经细胞功能有可能恢复；损伤重者，神经细胞功能不能恢复。
A study of the dark neurons and cytoskeleton changes of seven infarcted brains
GAO JingGUO YupuZHAO Qingjie.
（Department of Neurology, PUMC Hospital,Beijing 100730, China）
Abstract：ObjectiveBy observing the cytoskeleton changes of seven infarcted human brains on autopsies,it was designed to find wheather the ischemic neurons and the dark neurons were reversible.MethodsWe selected 7 autopsy brains of the cerebral infarction patients. We devided each infarcted brain into four areas on the large section for each whole infarcted brain. We then examined the microtube associated protain 2 (MAP2) and 200 kd neurolfilaments(NF200) by immunohistochemistry.ResultsThe area 0 with disappearance of MAP2 and NF200 represented a necrotic area. The area 1 with of NF200 and MAP2 dramatic abnormal changed of NF200, disclosed an irreversible area. The area 0 together with area 1 formed the central necrosis area. The area 2 with gently changes of MAP2 and NF200 and GFAP positive astrocyte hyperplasia, represented the possible penumbra in the reversible area. The area 3 with normal cytoskeleton and astrocyte hyperplasia disclosed the reflecting area and possible chronic penumbra. The dark neurons consisted of 80%～90% in the area 1,there were 40 %～50% in area 2, a few of them were positive with fuschin,alizerin and safracin staining ( FAS positive) and all of them were TUNEL negative.ConclusionsThe dark neurons might be considered one of the major neuronal changes following ischemia.A few of the irreversible dark neurons had FAS positive staining in the early apoptosis stage. Most of the dark neurons had no apoptosis. One part of the ischemic neuron with dramatic cytoskeleton changes was irreversible, whereas the other part of them with gentle changes of cytoskeleton was reversible.
Keywords：Cerebral infarction; Neurons; Cytoskeleton▲
脑梗死治疗的目的，一是使处于可逆性损伤阶段的细胞恢复功能，二是减少神经元的继续损伤，如炎性损伤、兴奋性氨基酸损伤及氧化应激等。因而，判定可逆性神经元损伤的存在范围及存在时间，对指导临床选择治疗时机是非常重要的。暗神经元（dark neuron）是缺血后神经元变化的形式之一，存在时间长、分布广，探讨其是否可逆及影响因素对于减少神经功能的损伤有意义。细胞骨架的变化与神经元的损伤是否可逆密切相关，其中的微管相关蛋白2（MAP2），在动物实验中可用来确定脑梗死的坏死区。为了探讨细胞骨架在人脑脑梗死中的变化及其暗神经元对脑梗死进展的意义，我们进行了此项研究，现报道如下。
资料和方法
一、 资料
尸检病例7例，年龄60～67岁。男4例，女3例，均来自哈尔滨医科大学第一医院神经内科。所检的大脑半球均为首次卒中，缺血时间为10、27 h和2、3.5、7、12及14 d。3例对侧半球有过卒中，但没有肢体瘫痪。7例均为大脑半球梗死，生前6例头颅CT扫描证实为大脑中动脉区梗死。4例伴糖尿病，2例伴高血压。无持续24 h以上的呼吸衰竭、休克等。生前无重要器官功能衰竭。死后24 h内局部剖检脑5例，48 h内剖检脑2例。剖检脑标本立即用10%福尔马林固定，所选病例固定时间为1个月至1年。实验前自来水冲洗24 h。
二、 方法
全脑冠状大切片，进行 HE、LFB染色。镜下按组织损伤程度分区，不同区域依次取小块，对细胞骨架蛋白的NF200、MAP2、GFAP进行免疫组化染色，用早期凋亡启动标记死亡受体FAS以及双链DNA片段出现后的TUNEL法检测凋亡细胞。因为是剖检脑，为了区分细胞骨架死后自然破坏、固定损伤与病变后的异常，注意每个病例的病灶内外及对侧的自身对照。
免疫组化采用SP法，特异性抗体均由宝灵曼公司提供。检测NF200、MAP2、GFAP的方法基本相同。二甲苯浸泡2次，酒精梯度脱水，蒸馏水洗（60℃加热）；0.4% Triton-100室温1 h，TBS洗3次；3%过氧化氢室温孵育5 min；蒸馏水洗，TBS浸泡5 min； 0．05%胰酶37℃ 30 min，TBS洗3次。煮沸加热修复抗原， 92～95℃ 20 min，室温自然冷却至37℃。10%正常山羊血清室温60 min。倾去血清，加入特异性抗体。检测NF200时加入50 μl(10 μg/ml)的特异性鼠抗人的神经丝（相对分子质量为200 000）单克隆抗体，室温1 h；检测MAP2时用MAP2抗体50 μl(10 μg/ml)，37℃,30 min；检测GFAP时用GFAP抗体50 μl (25 μg/ml)。抗体用TBS稀释；TBS洗5 min，3次；滴加生物素标记的二抗，37℃，30 min；TBS洗3 min，3次；辣根酶标记的链酶卵白素37℃孵育30 min；TBS洗3 min，3次；DAB显色；苏木素复染；常规树胶封片。
FAS的处理过程略有不同。脱蜡前60℃ 5～10 min，玻片浸于pH 6.0的柠檬酸缓冲液中，修复抗原同前；洗片封闭用PBS、PBSA-001、PBSA-1，抗体工作液浓度为1∶100。用TUNEL方法，按细胞死亡检测试剂盒说明书操作。
结果
按神经元变化分为4个区(0～3区)。0区出现嗜伊红神经元或组织结构消失，也可以有血管增生和红细胞渗出。1区低倍镜下显示结构分层紊乱，细胞密度低，以暗神经元为主（图1）；神经元有缺失，缺血10 h以上者无形态正常神经元。2区可见充血或血管增生，细胞周围水肿，有暗神经元，40%以上细胞形态正常。3区HE染色显示细胞形态正常，免疫组化显示星形细胞增生和肿瘤坏死因子α阳性表达增加。关于分区的依据另文详述。
缺血后神经元的变化形式有：暗神经元、嗜伊红神经元、细胞影及细胞消失，还有一部分肿胀的神经元。细胞核仁偏位，核变形，尼氏染色突起明显，胞体变形。暗神经元在1区占80%～90%，2区占40%～60%。暗神经元分布于梗死形成的坏死组织与正常组织的移行区，即本组资料的1区和2区。随着缺血时间的延长，与坏死相邻侧脑组织内嗜伊红神经元渐多，暗神经元渐少。缺血10 h暗神经元主要在皮层的II、III 层，之后逐渐向深层发展。血管增生部位暗神经元减少。
0区的NF200、MAP2均消失，梗死12 d时胞体内MAP2呈强阳性显色；1区MAP2消失或胞体显色强，2 d时呈球拍样，NF200断裂、弯曲，缺血2天内NF200有变形，但仍纤细，呈螺丝样或轻度变形，排序紊乱（图2）；2 d后明显增粗者多见，重度变形者呈线头状及碎点状（图3），暗神经元部分同样变化；2区的NF200和MAP2表现异常，但程度轻，NF200有变形，增粗不明显，排序尚可（图4），MAP2突起弯曲，呈类串珠样或增粗（图5，6），胶质纤维酸性蛋白（GFAP）显示星形细胞有增生（图7），但暗神经元部分偶见轻度NF200变化，不伴MAP2改变；3区及对侧的MAP2、NF200均正常。对侧MAP2突起细直显色明显，胞体显色略淡；NF200细直排列有序，偶有断裂和弯曲；GFAP显示有星形细胞的簇样增生。只有1个病例在1区的暗神经元部分有FAS阳性表达（图8）。TUNEL在暗神经元部分无阳性反应。
