关键词： 脑缺血；前列腺素内过氧化物合酶

摘要：目的观察大鼠持久性脑缺血不同时相过程中脑组织环氧酶-2蛋白的表达特性。方法采用线栓法大鼠大脑中动脉阻塞模型，以尾壳核平面为模板，应用免疫组织化学方法观察假手术组及缺血1、4、12、24和48 h组环氧酶-2蛋白阳性染色细胞的分布部位及数量。结果 正常对照组、假手术组、缺血1和4 h组均无阳性染色细胞，缺血12 h阳性染色细胞开始增多［(46±19） 个/mm²］,缺血24 h达到高峰［(70±14） 个/mm²］，缺血48 h阳性细胞数量减少［(41±13） 个/mm²］，差异有显著意义。阳性染色细胞仅见于额顶部大脑皮质上部、扣带皮质中细胞形态完整的神经元及血管内皮细胞，而胶质细胞并无着色。结论环氧酶-2蛋白主要由缺血半暗带的神经元和血管内皮细胞表达，缺血早期环氧酶-2蛋白并不表达，表达时间具有延迟性，提示其可能与迟发性神经元损伤有关

The expression of cyclooxygenase-2 in focal cerebral ischemia in rats

ZHANG ZaiqiangLONG JieLU Dunyue

（Department of Neurology, Tiantan Hospitol, Beijing 100050， China）

Abstract：ObjectiveTo explore the characteristic of the expression of COX-2 protein in different intervals following permanent focal cerebral ischemia in rats.MethodsA model of the middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats was performed with the intraluminal filament occlusion. The rats brains were cut in the coronal planes at the levels of the caudoputamen as the templates.The immunohistochemistry staining was used to facilitate the observation of the distributions and quantities of COX-2 protein in the brain tissues following the sham operation and the permannent MCAO for 1 h, 4 h,12 h, 24 h and 48 h respectively.ResultsThere were no immunochemistry positive staining among the control group,the sham operation group,and the beginning ischemic group with MCAO for 1 h and 4 h. However, a significant increase in COX-2 immunostaining was detected 12 h after MCAO ［(46±19)/mm²］. It was most marked 24 h ［(70±14)/mm²］, by 48 h after MCAO the positive staining cells gradually decreased ［(41±13)/mm²］. The difference among those groups was significant (P＜0.01). The immunochemistry positive staining only occurred in the neurons and vascular endothelials in the upper frontoparietal cortices and cingulate gyri,whereas the gliocytes did not show positive staining.ConclusionThe induction of COX-2 protein was evident in neurons and vascular endothelials at the ischemic penumbra,and the characteristics of the delayed expression indicated that it might involve in the mechanism of delayed neuronal death.

Keywords：Cerebral ischemia; Prostaglandin-endoperoxide synthase▲

缺血后磷脂酶A₂激活，促进膜磷脂降解，大量形成花生四烯酸，后者在环氧酶作用下，代谢成为前列腺素和血栓烷素。目前，2种不同的环氧酶（COX）基因已被确定：COX-1呈结构性表达，而COX-2的表达受炎性刺激和突触膜激活的诱导。以往的实验资料表明，脑缺血后脑实质中前列腺素和血栓烷素水平升高，这种增高的效应可被预先应用环氧酶抑制剂所阻断；在短暂全脑缺血实验中发现，环氧酶抑制剂可改善缺血神经元损害，这就意味着花生四烯酸环氧酶途径代谢产物在缺血神经元中毒机制中具有重要作用。在本研究中，我们用免疫组化方法对大鼠持久性脑缺血不同时相过程中脑组织环氧酶-2蛋白的表达进行了观察。现报道如下。

材料和方法

1.实验动物：Wistar雄性大鼠55只，体重250～300 g，月龄2.5～3.0个月，由中国医学科学院动物研究所提供。随机将大鼠分为正常对照组、脑缺血1、4、12、24及48 h组，缺血组各配1个假手术组，每组5只。

2.大鼠大脑中动脉阻断局灶性脑缺血模型：参照Longa等^［1］的线栓法，略有改进，栓线采用直径0.22 mm尼龙鱼线，头端5 mm膨大(直径约0.25～0.28 mm)。栓线从颈外动脉与颈总动脉分叉处进线约20 mm遇阻即止；全部大鼠均栓塞右侧大脑中动脉。假手术组栓线进入15 mm,于各时间点断头取材。统一采用尾壳核平面脑切片(视神经末端冠切)^［2］作为观察对象。

3抗体：COX-2抗体(山羊抗鼠IgG,Santa Cruz公司)，稀释度为1∶100，二抗生物素化兔抗山羊IgG(Santa Cruz公司)，抗体稀释度为1∶100。

4.免疫组化染色方法：标本组织常规酒精脱水透明、石蜡包埋，切片5 μm 厚，采用免疫组化ABC法染色，二氨基联苯胺显色系统显色；流水终止反应后苏木素液复染，盐酸酒精分化、清水返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片观察。

5.观察方法：应用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统对染色阳性细胞进行记数。

6.统计方法：应用Systat统计软件包的方差分析对数据进行处理。

结果

正常对照组、假手术组、左侧大脑组织、缺血1 h和4 h组均未见阳性着色细胞，缺血12 h组右侧额皮质及扣带皮质可见浅淡棕黄染色细胞，缺血24 h组右侧额皮质、扣带皮质及尾壳核内侧部神经元深重染色，到缺血48 h仅右侧扣带皮质中细胞形态尚完整的神经元有阳性染色；着色部位为神经元的胞浆和核膜（图1，2）。在缺血的所有时程胶质细胞都无阳性染色，而在神经元阳性染色的时程及区域，血管内皮细胞出现阳性染色。COX-2染色阳性细胞记数可见：缺血12 h阳性细胞开始增多［(46±19） 个/mm²］,缺血24 h达到高峰［(70±14） 个/mm²］,缺血48 h呈下降趋势［(41±13） 个/mm²］，差异有显著意义（P＜0.01）。

图1缺血24h半暗带COX-2阳性着色的神经元数量达高峰。抗COX-2免疫组化染色×400

图2缺血48h半暗带区仅细胞形态完整的神经元呈出COX-2阳性着色。抗COX-2免疫组化染色×400

讨论

COX-1蛋白本身存在于细胞内，在正常情况下持续产生大量前列腺素，维持细胞的基本功能；而COX-2在生理状况下不存在于细胞内，只有在细胞受到某些刺激诱导后才形成，其形成过程较为缓慢，Wu等^［3］报道，用白介素-1刺激人脐静脉内皮细胞后2 h，COX-2 mRNA开始表达，6～8 h后蛋白开始表达，同时有前列环素(PGI₂)形成，在18～24 h蛋白表达水平达到最大值。我们发现，在脑缺血刺激的状况下，神经细胞COX-2蛋白的表达同样遵循这一规律。

脑缺血后COX-2蛋白表达水平增高的原因：在COX-2基因的启动子区存在转录因子AP₁、SP₁等结合序列，可以调控COX-2基因的转录速度和水平^［4］。脑缺血的早期即刻早期基因c-fos、c-jun的表达水平增加，迁移率变动分析发现，脑缺血时转录因子AP₁（FOS与JUN的复合物）的DNA结合活性增高，由此可能增加COX-2蛋白的表达。据此有人推测， COX-2基因可能是即刻早期基因（c-fos、c-jun）的效应基因。

局灶性脑缺血后存在着缺血中心区及围绕中心区的半暗带，以往的实验研究结果证实，大鼠额顶皮质上部、扣带皮质及尾壳核内侧部由大脑前、大脑中动脉共同供血，缺血早期该区神经元损伤轻微，但随着缺血时间的延续，逐渐演变成为坏死区的一部分，因而被认为是“缺血性半暗带”的组织学等值区^［5］。我们观察到，COX-2蛋白主要由半暗带的神经元表达，尤其是由细胞形态完整的神经元表达，而胶质细胞并不表达。

COX-2蛋白在半暗带区延迟表达的特性说明，该酶并不介入脑缺血的急性损伤反应，而可能与缺血半暗带区的迟发性神经元死亡有关。目前，人们对COX-2在细胞死亡机制中的作用仍不十分清楚，部分研究者认为COX-2诱导细胞凋亡，Tocco等^［6］观察了注射红藻酸后大鼠大脑神经元COX-2蛋白的表达和神经元凋亡，发现过度表达COX-2的神经元与具凋亡特征的神经细胞在解剖部位上重叠，在出现时间上一致；对神经元作单型细胞培养，用谷氨酸处理，观察到COX-2蛋白高度表达的神经元出现凋亡。Nakagomi等^［7］观察到环氧酶抑制剂吲哚美辛可抑制沙土鼠海马神经元延迟性损伤。缺血半暗带区增高的COX-2蛋白可能利用该区残留的氧供，产生大量的细胞毒性氧自由基，从而对膜磷脂、蛋白和DNA产生损害作用；COX-2能增加前列腺素和血栓烷素的形成，这些产物为一类炎性因子，可促进中性粒细胞的慕聚，释放蛋白水解酶和自由基，对神经细胞产生损伤作用；COX-2还<