关键词： 淀粉样β蛋白；脱噬作用；褪黑激素；神经元

摘要：目的探讨凋亡机制在β-淀粉样蛋白（Aβ）脑内致阿尔茨海默病（AD）作用中的意义及褪黑素（MT）对Aβ脑内神经毒性的干预效果。方法将Aβ_1-40微量注射至大鼠右侧海马CA1区，7 d后，用尼氏染色检测神经元丢失，HE染色、TUNEL染色及透射电镜检测细胞凋亡；用免疫组化SABC法检测Bax/Bcl-2的表达。结果Aβ组右侧海马CA1区发现大量凋亡细胞，而假手术对照组和生理盐水对照组未发现细胞凋亡；Aβ组Bax表达增强，而Bcl-2表达在上述三组间无明显差异；MT组海马CA1区神经元计数为47.4±5.9，明显多于Aβ组（29.4±4.5），但少于生理盐水对照组（79.8±7.6）和假手术对照组（83.1±8.5），MT组细胞凋亡（8.4±3.7）少于Aβ组（18.9±6.1）。结论Aβ能诱导脑内神经元凋亡，并可能与促进Bax的表达有关；MT能明显减轻Aβ的脑内神经毒性，补充MT可能有助于AD的防治。

Apoptosis induced by β-amyloid protein in rat brain and protection by melatonin in the rat brains

GAO QuwenCHEN JunpaoTIAN Shiyuet al.

（ Department of Neurology,Zhujian Hospital,The First Military University, Guangzhou 510282， China）

Abstract：ObjectiveTo investigate both the role of apoptosis in the pathogenesis of Aβ and the therapeutic effect of melatonin on the neurotoxicity of Aβ in the rat brains.MethodsAβ_1-40 was microinjected into CA1 subfield in the right hippocampus of rats.Seven days later, apoptosis of the neurons was determined with the use of Nissl staining, hematoxylin-eosin staining,TUNEL staining and transmission electron microscopy(TEM).The expression of Bax/Bcl-2 was determined with immunohistochemistry SABC method.ResultsIn the Aβ group, hematoxylin-eosin staining showed many neurons in the CA1 subfied cell-bodies became shrunken,whereas the chromatin were condensed and deeply stained. TUNEL staining indicated that lots of cells with nuclei brown-yellow stained and ringed. The TEM examination revealed compact patches or rings or cells like crescent moons with condensed nuclear chromatin but with no apparent nuclear membrane disruption. In comparision with the control groups,the expression of the Bax in the hippocampal CA1 subfields in the Aβ group was stronger,but the expression of Bcl-2 showed no obvious difference among the above three groups. The numbers of the neurons in the hippocampal CA1 subfields in the melatoin group were 47.4±5.9，more than in the Aβ group （29.4±4.5）, but less than in the normal saline control group （79.8±7.6）or in the sham operation control group （83.1±8.5）. Apoptotic cells in the melatonin group （8.4±3.7）were less than in the Aβ group （18.9±6.1）. ConclusionsThe result of this study indicated that Aβ could induce the neuronal apoptosis in the rat brains, and the stronger expression of Bax might play an important role in those neuronal apoptosis, whereas, melatonin could markedly inhibit the neurotoxicity of Aβ in the rat brains, which suggested that complementing of melatonin might be beneficial for the prevention and therapy of Alzheimer′s Disease.

Keywords：Amyloid beta-protein; Apoptosis; Melatonin; Neurons▲

阿尔茨海默病（AD）的临床症状主要是智力进行性减退，病理特征：细胞外存在大量由β-淀粉样蛋白(Aβ)组成的老年斑(SP)、神经元纤维缠结形成和皮质、海马选择性神经元丢失，其中海马病变早于皮质，在疾病早期海马CA区神经元便明显减少^［1］。目前认为，AD脑内神经元的丢失可能与细胞凋亡有关。体外研究发现SP的核心成份——Aβ,能诱导神经元的凋亡，但在体条件下这方面的研究少见报道。本实验利用微量注射器直接将Aβ_1-40注入大鼠右侧海马CA1区，诱导Aβ在该区域的沉积，深入探讨了Aβ脑内沉积的致凋亡病理效应，并同时观察了MT对Aβ脑内神经毒性的干预效果。

材料和方法

一、材料

1.实验动物：雄性SD大鼠44只，月龄2.5个月， 体重200～250 g，由第一军医大学实验动物中心提供。

2.主要试剂：Aβ_1-40（美国Sigma公司），褪黑素（MT，美国Sigma公司），原位细胞凋亡检测试剂盒（德国Boehringer Mammheim 公司），Bax（p-19）、Bcl-2（N-19）兔抗鼠多抗（美国Santa Cruz Biotechnology公司），SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

二、方法

1. 动物饲养及分组：大鼠自由饮食，光照每日12 h。44只SD雄性大鼠随机分为生理盐水对照组、假手术对照组、Aβ组和MT组。前三组每组动物12只（其中4只做电镜检查），MT组8只。

2. Aβ的孵育：用无菌生理盐水将Aβ_1-40稀释成10 μg/μl，37℃下孵育1周，使其变为聚集状的Aβ^［2］。

3.动物模型的制作：SD大鼠（Aβ组及MT组）麻醉后固定于脑立体定向仪上，钻开颅骨，切开硬脑膜，按脑立体定位仪图谱 ，于前囟后3.0 mm，中线右侧2.0 mm处用微量注射器自脑表面垂直进针2.6 mm，然后将 1 μl Aβ_1～40（10 μg/μl)缓慢注入。7 d后灌注取脑做成蜡块，每只动物在损伤最明显处附近连续取带针道的切片20张，片厚5 μm，并分为5套，分别做尼氏染色、HE染色、TUNEL法标记、Bax及Bcl-2免疫组化（MT组任选两套，只做尼氏染色及TUNEL法标记）。假手术对照组切开硬脑膜后即缝合伤口，并在大致相应位置取材和切片，生理盐水对照组注入等体积的生理盐水。MT治疗组术后即经腹腔注射MT 1次（0.5 mg/100 g体重），以后每日定时腹腔注射1次，共7 d，Aβ组、假手术对照组及生理盐水对照组用10%的乙醇生理盐水代替。

4. 尼氏染色检测海马CA1区神经元丢失：每只动物取一套切片做尼氏染色（硫堇法），将针道与海马CA1区锥体细胞带的交叉点放在视野中央，在40倍物镜下进行尼氏染色阳性细胞（胞浆呈紫蓝色，胞核呈淡蓝色）计数，总和除以4，作为该动物CA1区的神经元计数，TUNEL法的凋亡细胞计数，除阳性细胞的判断标准外，其他同尼氏染色神经元计数。

5.HE染色检测细胞凋亡：HE染色光镜下判断凋亡细胞的标准^［3］： 发生在散在单个细胞，整个胞体缩小并有核固缩或核碎裂；或形成凋亡小体。

6.TUNEL法检测细胞凋亡：操作程序按原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行，阳性对照采用加TUNEL反应液前用核酸酶（10 μg/ml）室温下10 min诱导DNA片段，阴性对照采用所加TUNEL反应液中不含末端转移酶。

7.透射电镜检测细胞凋亡：动物注射Aβ 7 d后，经2.5%戊二醛磷酸缓冲液灌注固定,先制成蜡块，在石蜡切片机上边切片边观察,至针道附近时,取含针道的组织约1 mm³，脱蜡后Spurr树脂包埋剂包埋、聚合、超薄切片,染色后置于透射电镜下观察并拍照（电压80 kV）。

8.免疫组化SABC法检测Bax/Bcl-2表达： 操作程序按SABC免疫组化染色试剂盒书进行。

9.Bax/Bcl-2免疫组化半定量标准： 阴性（-）：无表达；弱阳性（+）：在若干细胞内表达，阳性细胞占整个视野的0%～25%，着色浅；阳性（++）：阳性细胞占整个视野的25%～50%，着色强度中等；强阳性（+++）：阳性细胞占整个视野的50%以上，着色深。

10．统计学方法：尼氏染色神经元计数结果采用完全随机设计的多样本均数比较的方差分析及Student Newman-Keuls法检验，TUNEL法细胞凋亡计数采用两组均数的t检验，以P＜0.05表示差异有显著意义。

结果

在Aβ组海马CA1区HE 染色高位镜下，可见其锥体细胞层不完整，其中许多细胞胞体缩少、胞浆呈淡红色、胞核固缩深染（图1）；TUNEL 染色阳性对照片可见大量阳性细胞，其胞核为均匀一致的棕褐色，阴性对照片未见阳性细胞，在Aβ组可见许多细胞胞核着棕黄色，不均匀，并呈环指样结构，有的细胞在其核外周可见棕黄色毛刷状结构,有的细胞胞浆也有着色，这些细胞主要在海马CA1损伤区，但不局限于锥体细胞层；透射电镜示许多神经元核边集呈环状、块状或新月状，但核膜完整（图2）。两对照组均无上述改变。Bax免疫组化染色方式为胞浆，Aβ组呈阳性（++），两对照组均为弱阳性（+）；Bcl-2免疫组化染色主要在核周，三组均呈强阳性（+++）。

图1Aβ组海马CAI区可见多个凋亡细胞，其胞体缩小，胞核固缩深染。HE染色×200

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