关键词： 帕金森病；左旋多巴；脱噬作用

【摘要】目的探讨左旋多巴(L-dopa)治疗帕金森病(PD)疗效减退的机制。方法以PC12(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤)细胞为多巴胺(DA)神经元的细胞模型，应用流式细胞术(FCM)、DNA琼脂糖凝胶电泳、透射电镜、碘化丙啶(propidium iodide, PI)/HO33342双染色法观察L-dopa对PC12细胞凋亡的影响，每组样本数为7。结果20 μmol/L L-dopa处理组的凋亡率2.5%与对照组2.3％比较无显著差异(P＞0.05)，但50、100、150 μmol/L的L-dopa作用24小时所致的凋亡率分别为12.4%、24.4%、37.2%，与对照组比较差异有非常显著意义(P＜0.01)。结论在一定浓度范围内的L-dopa可以诱导PC12细胞调亡，提示调亡可能参与了L-dopa治疗PD疗效减退的病理过程。

Experimental research on the apoptosis of PC12 cells inuced by L-dopa

HAN Yan, CHEN Junpao, TIAN Shiyu, et al.

Deparment of Neurology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282

【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanism of the decline in effectiveness during the treatment of Parknson's disease with L-dopa.MethodsIn this study, we used flow cytometry、angarose gel electrophoresis, electron microscopy and PI/HO33324 double staining to detect the induction of apoptosis of the catecholaminergic PC12 cells by L-dopa.ResultsThe ratios of apoptosis induced by L-dopa at the ranges of the contents of 50,100 and 150 μmol/L were 12.4%,24.4%,37.2% respectively; significantly higher than those of the control group (P＜0.01), while the ratio of apoptosis induced by L-dopa at the concentration of 20 μmol/L was similar with that of the controls(P＞0.05).ConclusionThe results suggested that apoptosis might be involved in the pathogenetic phase, when the effectiveness of the treatment with L-dopa was declining.

【Key words】Parkinson diseaseLevodopa Apoptosis

帕金森病(PD)是由中脑黑质致密部多巴胺神经元选择性变性、死亡，纹状体多巴胺减少所致，其发病机制目前并不很清楚。近期越来越多研究发现凋亡这一细胞死亡方式在PD发病中有重要作用^［1］。虽然治疗PD的措施比较有效，但大多是缓解症状，还没有在早期即能够阻滞多巴胺神经元变性死亡的措施。左旋多巴(L-dopa)及其复方制剂是最常选用且最有效缓解症状的药物，但在长期服药后，疗效会逐渐减退^［2］。目前L-dopa治疗PD疗效减退的机制，特别是在临床药物浓度下的毒性机制还不很清楚。本实验研究L-dopa对PC12细胞凋亡的影响，以探讨L-dopa治疗PD疗效减退的机制。

材料与方法

1.实验仪器及试剂：EPICS ELITE 型流式细胞仪(美国Coulter公司)，JEM-1200型电镜(日本JEOL公司)。碘化丙啶(PI)、HO33342、左旋多巴、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、多聚赖氨酸(Sigma公司), 核糖核酸酶(RNAse)、蛋白酶K(德国Boehring Mannheim公司)。达尔伯克必需基本培养基(DMEM)、马血清(GIBCO公司)。余试剂为国产分析纯。

2.细胞培养及药物处理：PC12 细胞(中科院上海细胞所)置于DMEM培养液中，内含10％马血清，5％胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，10% HEPES，培养瓶预先铺以100 mg/L的多聚赖氨酸。于对数生长期加入L-dopa处理，使其终浓度分别为20、50、100、150 μmol/L，对照组加入DMEM液，每个浓度组及对照组各7瓶，37℃，5%CO₂孵箱培养，24小时后收集细胞。

3.流式细胞术检测L-dopa 诱导PC12细胞凋亡：PC12细胞以1×10⁶/ml接种于50 ml培养瓶中，培养及处理方法同前，24小时后收集细胞。按Schmid等^［3］方法制样(PBS洗2次，70％冷乙醇固定，PBS重悬制备单细胞悬液，加入RNAse至终浓度50 mg/L, 室温放置30分钟)，PI(100 mg/L)染色，Elite 流式细胞仪采集数据。

4.DNA 琼脂糖凝胶电泳：细胞培养和药物处理方法同前，24小时后收集5×10⁶/ml 细胞，裂解液裂解，RNAse、蛋白酶K孵育，酚抽提，乙醇沉淀，每样品取10 μg DNA经1.8％琼脂糖电泳。电泳后凝胶用计算机图像分析系统(CDAS)和GelBase/GeIBIot软件(UVP ImageStore7500, 英国)做定量分析。

5.碘化丙啶(PI)/HO33342 双染色法观察：细胞培养及药物处理同前，按Chen等^［4］方法并加以改进，基本步骤如下：药物处理24小时后收集细胞，悬浮于1 ml培养基中，加入10 μl HO33342储存液(100 mg/L, 蒸馏水溶解)，混匀，置37℃，染色15分钟；将细胞置于冰上冷却后，离心，去上清；将细胞重悬于1 ml PBS中，加入5 μl PI储存液(1 g/L, 蒸馏水溶解)，立即用荧光显微镜进行观察分析(激发光波长250 nm)。

6.透射电镜观察L-dopa处理的PC12细胞: 细胞培养及处理同前，24小时后收集，用琼脂糖预包埋法制样，常规固定，制作超薄切片，透射电镜观察、摄片。

结果

1.流式细胞仪检测结果：凋亡细胞DNA断裂形成不同大小寡聚核苷酸片段，在FCM的DNA图上表现为G₁峰前形成特征性亚二倍体峰(Ap峰)，根据该峰所占比例，可进行凋亡的定量分析^［5］。50、100、150 μmol/L处理组的凋亡率分别为(12.46±0.43)%、(24.48±0.37)%、(37.21±1.15)%，较对照组凋亡率［(2.34±0.28)%］经t检验显示均显著增高(P＜0.01)，20 μmol/L处理组的凋亡率为(2.57±0.04)%，与对照组比较，差异无显著意义(P＞0.05)。

2.DNA琼脂糖凝胶电泳结果：凋亡细胞的寡聚核苷酸片段在琼脂糖电泳上表现为梯形条带(ladder)，是细胞凋亡的生化特征。实验结果显示，对照组、20 μmol/L组未出现DNA条带，50 μmol/L组开始出现少量条带，100 μmol/L组条带增多，而150 μmol/L组则呈现典型的梯状，见图1。

1：对照组，2～5：L-dopa 20、50、100、150 μmol/L组，6：标准

1不同浓度L-dopa处理PC12细胞24小时后DNA凝胶电泳结果

3.DNA降解的定量分析：CDAS分析DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示，对照组，20、50、100、150 μmol/L各浓度组细胞DNA片段化比例分别为2.5%、2.7%、13.3%、25.7%、39.8%。

4.PI/HO33342双染色结果：带有电荷的荧光染料PI能与死细胞的DNA、RNA结合，而HO可以渗透过细胞浆膜，使活细胞和凋亡细胞DNA都能染色，经紫外光激发，可分别产生红色和蓝色荧光。凋亡细胞在等渗条件下吸收HO的能力增强，所以蓝色荧光最强的是凋亡细胞，有的可见染色质碎裂，其次是正常细胞，而坏死细胞由于PI的复染呈红色荧光，见图2。

图2蓝色荧光最强的是凋亡细胞，可见染色质碎裂，蓝色荧光较弱的是正常细胞，红色荧光是坏死细胞。PI/HO双染×400

3早期凋亡细胞，溶酶体、线粒体增生，胞核固缩不明显。电镜铅铀双染色×8 000

4晚期凋亡细胞，胞浆浓缩，出现空泡，胞核固缩成均质状。电镜铅铀双染色×8 000

5.透射电镜观察结果：50、100、150 μmol/L处理组细胞有的胞浆中溶酶体增多，线粒体增生，此时胞核固缩不明显，为早期凋亡细胞，见图3；有的胞核固缩成均质状，胞浆浓缩，胞质中出现大量空泡，溶酶体消失，剩下很多颗粒状残余物，为晚期凋亡细胞，见图4。

讨论

PC12细胞株源于大鼠嗜铬细胞瘤，常规条件下培养，该细胞株性质与嗜铬瘤细胞相似，可作为一种儿茶酚胺细胞，当用神经生长因子处理后，可分化成交感神经元样细胞，这种分化使其在形态、生理、生化功能方面更接近于神经元，因此，PC12细胞同时具有神经分泌细胞和神经元的性质，已被广泛用于神经细胞死亡方式及神经毒理方面的研究，又因PC12细胞含有的酶类、膜受体及合成的递质等方面很接近于中脑多巴胺神经元^［6］，因此，我们选PC12细胞作为多巴胺神经元的细胞模型。虽然对PC12细胞的研究结果无法完全代替黑质多巴胺神经元，但可以间接地为基础研究或临床治疗提供新的思路。

L-dopa及其复方制剂仍是目前最有效的抗PD药物，但L-dopa的疗效一般在2～4年后就逐渐减退，这种疗效减退与病程早晚无一定关系，而且常常会出现运动波动、运动障碍、精神症状等副作用，其原因可能有的与药物的血浆浓度变化有关，有的与药物的代谢产物的作用以及长期用药D₁、D₂受体不同程度的耐受有关，而有的则可能是黑质、纹状体多巴胺合成、储存减少所致^［7］。早期研究已证实L-dopa对体外培养的神经元有毒性作用^［8