关键词： 肝豆状核变性；基因；突变；限制酶图谱法

【摘要】目的建立Wilson病(WD)基因突变热点的快速检出方法，并探讨其在WD临床可疑患者诊断中的价值。方法PCR扩增我国WD基因的突变热区——第8号和12号外显子，分别以限制性内切酶MspI和TaiI消化扩增产物, 2%琼脂糖凝胶电泳分离，得出相应限制性酶切图谱并进行分析。56例非同源家系的WD患者及60例正常对照进行了该项检测。其中44例同时进行这两个外显子的测序检测。结果37.5%(21/56)的WD患者在第8号外显子检测到Arg778Leu/Gln点突变,其中12例为纯合点突变,9例为杂合点突变，染色体突变频率为29.5%(33/112)。16.1%(9/56)的患者在第12号外显子检测到Thr935Met点突变,均为杂合点突变, 染色体突变频率为8.0%(9/112)。结果与测序相符。结论采用限制性酶谱分析法可准确检出WD基因最常见的两个突变点，有助于对临床可疑患者进行诊断。并具有简便快速、结果清晰可靠、不需用同位素等优点，易于推广应用。

Rapid detection of the hot point mutations of Chinese Wilson disease′s gene with PCR-based restriction fragment length polymorphism

WANG Ning, WU Zhiying, LIN Minting, et al.

Institute of Neurological Sciences, Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian 350005

【Abstract】ObjectiveTo establish a rapid method to detect the hot point mutations of Wilson disease (WD) gene and to investigate its clinical application value.MethodArg778Leu/Gln of exon 8 and Thr935Met of exon 12 were hot point mutations of Chinese WD gene. They were amplified by polymerase chain reaction (PCR), analyzed by digestion with restriction enzymes MspI and TaiI, respectively, and followed by 2% gel electrophoresis of the cleavage products. 56 unrelated WD patients and 60 unrelated normal controls were screened with this method.ResultsArg778Leu/Gln of exon 8 was detected in 37.5%(21/56) patients. Among them, 12 patients were homozygous and another 9 patients were heterozygous for this mutation. The frequency of the mutation was 29.5% (33/112). Thr935Met of exon 12 was detected in 16.1%(9/56) patients and 9 cases were all heterozygous for this mutation.The frequency of the mutation was 8.0%(9/112). The result of this method was the same as that of the DNA sequencing.ConclusionA direct diagnostic system based on the method described here would, therefore, be expected to identify the two most common mutations of Chinese WD gene and help to diagnose WD cases suspected on clinical grounds. The advantage of the method would be that no radioactive PCR and electrophoresis were needed, and that the results were clear,and unambiguous. With this method, it would be possible to diagnose the WD patients accurately, conveniently and rapidly.

【Key words】Hepatolenticular degenerationGenePoint mutationRestriction mapping

Wilson病(WD)是一种可有效对症治疗的常见神经遗传病,但早期诊断和治疗是改善本病预后的关键。本病基因定位于13q14.3^［1］，共有21个外显子,其基因突变特点具有遗传异质性。国外研究发现，14号外显子的His1069Gln和18号外显子的Gly1266Arg为欧洲人WD基因突变热点^［2］，而我们的测序研究结果显示，8号外显子的Arg778Leu/Gln突变和12号外显子的Thr935Met突变为我国WD基因突变热点^［3,4］，国内一些作者的研究，亦证实8号外显子的突变频率较高^［5］。由于第8和12号外显子的正常序列分别存在一个MspI和TaiI的酶切位点，当发生上述点突变时，相应的切点丢失。据此，我们采用PCR扩增结合限制性酶图谱分析的方法，对56例非同源家系WD患者进行上述点突变检测，以探讨该方法的应用价值，现报道如下。

对象和方法

一、研究对象

1.无亲缘关系的正常对照60名，男女各半, 经遗传咨询证实家族中无遗传病史。

2.非同源家系的WD确诊患者56例，其中男34例，女22例，起病年龄5～39岁，均经我院神经科确诊。诊断标准：(1)有锥体外系表现和(或)肝损害表现及精神异常等临床症状; (2)血清铜蓝蛋白＜200 mg/L；(3)裂隙灯下检查角膜K-F环阳性。

二、方法

1.DNA制备：抽取上述研究对象外周静脉血10 ml，枸橼酸-枸橼酸盐-葡萄糖(ACD)抗凝，分离白细胞后按常规盐析法抽提基因组DNA。

2.PCR扩增：扩增WD基因第8和12号外显子的引物与文献［2］一致，由上海生工公司合成。50 μl PCR反应体系中,基因组DNA250 ng，dNTP各200 μmol/L，引物各0.25 μmol/L，Taq酶2.5 U及其10×缓冲液。采用美国MJ公司PCR自动扩增仪扩增。条件为:94℃变性45秒，60℃或56℃(第12号外显子)退火45秒，72℃延伸1分钟，30次循环。扩增产物长度分别为296 bp和229 bp。

3.限制性内切酶消化：每份样品反应的总体积为30 μl。对于第8号外显子,每个反应体系中分别含扩增产物15 μl、MspI(MBI产品)5 U、10×缓冲液和0.5%小牛血清白蛋白3 μl，37℃孵育5小时使样品完全酶切。12号外显子每个反应亦含PCR产物15 μl，TaiI(MBI产品)5 U及其相应缓冲液，覆盖20 μl石蜡油,65℃孵育8小时使样品完全酶切。

4.酶切产物电泳检测及限制性图谱分析：采用2.0%琼脂糖凝胶，1×TBE电泳缓冲液，50 V电压电泳2.5小时。加样体积为15 μl，含酶切产物13 μl和6×加样缓冲液2 μl，以pGEM-3Zf(＋)DNA/HaeⅢ为分子量标记。电泳结束后，紫外灯上观察、拍照。根椐每份样品酶切产物电泳分离得到的限制性片段长度，判定结果。

结果

一、WD基因8号外显子的酶切结果

8号外显子在正常时仅有1个MspI位点，完全酶切可得到237 bp及59 bp两种片段。发生Arg778Leu/Gln纯合突变的患者, 因两条染色体上778位密码子均由CCG突变为CTG/CAG，使DNA顺序5′..CCGG..3′变成5′..CT(A)GG..3′，无法被MspI识别，仍为单一的296 bp片段。杂合突变患者完全酶切后，将同时得到296 bp、237 bp及59 bp三种片段。本组56例WD患者中，36例酶切结果与正常对照相同，呈现237 bp条带(59 bp条带均已走出胶)，说明未发生该点突变；12例患者仅呈现296 bp片段，判断为纯合突变患者；其余9例同时具有296 bp和237 bp二个条带，为杂合突变患者(图1)。WD患者该点的突变检出率为37.5%(21/56),染色体突变频率为29.5%(33/112)。

1：正常对照；2,4，8：WD患者未发生Arg778 Leu/Gln突变；3，5：WD患者检出杂合突变；6,7：WD患者检出纯合突变；M：pGEM-3Zf(＋)DNA/HaeⅢ分子量标记

1Wilson病基因8号外显子MspI 限制性酶切图谱

二、WD基因12号外显子的酶切结果

与8号外显子相似，WD基因12号外显子第935密码子序列构成了TaiI切点,即5′..ACGT..3′,完全酶切得到140 bp及89 bp片段。发生Thr935Met点突变后，即由ACG变成ATG，使DNA顺序变成5′..ATGT..3′，TaiI切点丢失。本组56例中,9例酶切产物同时具有229 bp、140 bp及89 bp片段，表明发生了Thr935Met杂合突变(图2)，患者突变检出率为16.1%(9/56), 染色体突变频率为8.0%(9/112)。3例发生了Thr935Met杂合突变的患者，同时检测到了Arg778Leu杂合点突变，因此,本组56例患者的突变总检出率为48.2%(27/56)。

1：未进行酶切的PCR产物对照；2～7：PCR产物酶切电泳图谱，其中，2：正常对照，3、6：未检出Thr935Met突变的WD患者，4、5、7：检出杂合Thr935Met突变的WD患者；M： pGEM-3Zf(＋)DNA/HaeⅢ分子量标记

2Wilson病基因12号外显子TaiI 限制性酶切图谱

讨论

WD是一种与铜代谢障碍有关的常染色体隐性遗传病,由于铜可沉积于全身多种脏器导致本病症状多样化，可表现为锥体外系症状、肝损害、肾功能障碍及角膜K-F环等。本病早期常易误诊或漏诊,错过治疗的有利时机,导致患者死亡或不同程度的病残。以往我们曾联合应用多个短串联重复顺序(STR)标记，建立了准确快速的间接基因诊断方法,可有效地检测或甄别有先证者家系的WD症状前患者和致病基因携带者,但对无先证者家系的WD临床可疑患者无法明确诊断。为此,我们进一步应用单链构象多态分析(SSCP)和DNA测序方法对44例非同源家系的WD患者进行WD基因3～20号外显子的突变筛查,发现8号外显子的Arg7