关键词： 神经胶质；巨细胞病毒属；小鼠

【摘要】目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)体外感染新生Balb/c乳鼠原代培养大脑神经胶质细胞的特征及其敏感性。方法建立了新生乳鼠大脑皮质细胞原代培养方法并进行病毒感染。在感染后的不同时间，分别在光镜下连续观察摄影记录，并取样42份，进行抗HCMV单抗的免疫组化染色和地高辛标记的HCMV寡核苷酸探针检测病毒核酸及其胞内定位分布的原位杂交试验。同时，同样取正常对照组培养片36份进行试验。结果HCMV能感染新生乳鼠大脑皮质细胞，受感染的神经胶质细胞，在感染后第4天即可观察到细胞病变，表现为细胞肿胀变圆。测定感染细胞上清中病毒半数组织培养感染量，表明病毒在细胞内复制。免疫组化和原位杂交结果均证实，HCMV感染后48小时，即可分别在受感染细胞内检出病毒早期抗原和病毒核酸；且上述阳性结果的出现均比在同期受感染的神经细胞早，易观察。结论新生乳鼠大脑皮质神经胶质细胞较神经细胞对HCMV更为易感染，表明前者在HCMV致中枢神经系统感染的建立及病理的发生发展中具有重要作用。

Susceptibility of primary cultured central neurogliocytes cells from the newborn mice to human cytomegalovirus

WANG Mingli^*, HU Wen, LI Jingpei, et al.

*Department of Microbiology, Anhui Medical University, Hefei 230032

【Abstract】ObjectiveTo investigate the susceptibility and feature of the central neurogliocytes from Balb/c newborn mice by primary culture in vitro to human cytomegalovirus (HCMV).MethodsThe central neurons and neurogliocytes were prepared and cultured, and the model for HCMV infection was made. The cells were observed and recorded with photography under the microscope, and the 42 neuron cell cultures were taken for the viral specific antigen, the viral DNA and its intracellular location were detected and analyzed with immunohis- tochemical stainning using HCMV specific McAbs and in situ hybridization utilizing digoxigenin labelled HCMV DNA probes, respectively， at 24 h,48 h, 72 h……1,2,3 and 4 weeks after infection.ResultsThe cytopathic effects of the central neurogliocytes were exhibited 4 days after HCMV postinfection, that is, the cells were beginning to enlarge and become round. The virus titer measured by TCID₅₀ assay was proved to be on the increase in the supernatant of the infected cells. Viral early antigens and its specific DNA sequences in the cells were detectable at 48 hours after the infection. These observed results occurred earlier than those of the neurons. However, nothing was found in the negative controls.ConclusionThe central neurogliocytes were more susceptible than the neurons to HCMV infection. This finding in regard to the central neurogliocytes suggested that they might play important roles for the establishment of the HCMV infection and its pathological development in the central nervous system.

【Key words】NeurogliaCytomegalovirusMice

大脑皮质神经胶质细胞分为星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞等4种，是组成中枢神经系统(CNS)最基本的形态和功能单位之一。近年来已认识到，神经胶质细胞不仅参与CNS损伤的修复，而且对神经系统的发育、生理以及病理都具有十分重要的作用^［1］。

人巨细胞病毒(HCMV)是引起先天性CNS感染的重要病原体之一，至今仍无有效疫苗预防。现知，HCMV先天性感染可导致CNS严重的神经病理性改变，其特征主要为严重的脑损害，包括组织灶性破坏性脑炎、脑钙化和小头畸形^［2］。

本研究首次在Balb/c新生乳鼠48小时脑细胞原代培养物上接种HCMV AD169株，连续4周较细致地观察了HCMV致鼠脑神经胶质细胞感染的细胞病理学改变，并运用免疫组化和原位杂交技术初步观察确定了神经胶质细胞对HCMV的易患性。

材料和方法

1.病毒： HCMV AD169株由上海医科大学微生物学教研室提供，成纤维细胞(HF)本室按常规培养增殖。使用前，将病毒在HF细胞上多次传代，以增加病毒毒力；按Gibson^［3］的病毒致细胞病变作用(CPE)终点稀释法以在24～48小时内出现 CPE 达“+++～++++”的病毒悬液在HF细胞上滴定半数组织培养感染量(TCID₅₀)；以6.0 log TCID₅₀/ml的病毒作为实验用毒种。

2.主要试剂：所用主要化学及分子生物学试剂分别购自Sigma公司、Promega公司和华美生物工程公司；地高辛DNA标记和检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。

3. HCMV即刻早期抗原(MIE)和晚期抗原(LA)寡核苷酸探针序列合成与标记：HCMV DNA MIE和LA寡核苷酸探针片段序列及位置同参考文献［4］设计，MIE寡核苷酸探针序列：5′GAGGCTATTGTAGCC- TACACTTTGG3′，序列位点为第900～925核苷酸；LA寡核苷酸探针片段序列为5′GTCGCCTGCACTG- CCAGGTGCTTCG3′，序列位点为第2301～2325核苷酸。用DNA合成仪固相亚磷酸三酯法合成并纯化(中国科学院上海植物生理所植物分子遗传国家重点实验室)。上述两种Digoxigenin标记的探针制备及检测按Boehringer Mannheim公司说明书进行。

4.新生乳鼠脑细胞原代培养物的制备:实验用当日生Balb/c乳鼠(本校实验动物中心)。原代培养物的制备基本参照吴希如等^［5］方法进行。然后将细胞接种至盛有已预先覆盖鼠尾胶原薄膜盖玻片的塑料培养皿内,最终细胞浓度为1×10⁶/ml。置37℃，CO₂饱和湿度的CO₂培养箱内培养，48小时后，分别于相应孔内加100 TCID₅₀病毒悬液0.1 ml，同时以相同病毒量感染人成纤维细胞作为阳性对照。

5.观察和鉴定方法:每隔2～3天于倒置显微镜下观察、摄影记录、换液；并在病毒感染后的第24、48、72 小时和第1～4周分别连续取样42片，用于细胞病理学染色及原位杂交检测等。

6.免疫细胞化学染色:将覆盖有细胞单层的盖玻片取出后风干，置冷丙酮固定15 分钟，PBS漂洗5分钟×3次后，依次进行下列两组免疫细胞化学染色：第一组根据胡刚等^［6］方法,在不同玻片上进行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经特异性烯醇化酶(NSE)染色。同时进行的第2组免疫细胞化学染色是在盖玻片分别加抗HCMV早期抗原和晚期抗原单抗(本室自制)，37℃保温2小时，用PBS洗3次，蒸馏水洗1次，吹干，加辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗，37℃保温1小时，再用PBS洗3次，最后用显色液显色。此组阳性细胞的确定均选择形态特征与GFAP和NSE阳性细胞相似的细胞为HCMV抗原阳性神经胶质细胞和神经细胞。每次所设阳性对照为HCMV感染HF细胞培养物，阴性对照为正常HF细胞培养物及正常乳鼠脑细胞培养物。

7.TCID₅₀滴定:于HCMV感染后的第1、2、3和4周分别吸取培养上清液，加50%山梨醇后，冻存于-70℃冰箱保存。在HF细胞上滴定病毒TCID₅₀值的方法同前。

8.原位杂交：载有单层细胞培养物的盖玻片经多聚甲醛固定后，用0.2 mol/L HCl作用20 分钟，蛋白酶K(20 μg/ml)37℃作用10 分钟；再用含甘氨酸(2 mg/ml)PBS洗5 分钟×2次，RNA酶A(100 μg/ml)37℃作用30 分钟，经上述甘氨酸PBS洗涤后，再以多聚甲醛行后固定。再洗涤后，在细胞单层上滴加预热的杂交液适量，37℃作用30 分钟，用预热杂交液稀释DNA探针并置100℃变性5 分钟后速冷；倾去预杂交液，加入DNA探针(3～10 ng/ml)；细心地盖上硅化盖玻片，边缘用石蜡油封闭后，置37℃杂交过夜。2×标准枸椽酸盐水(SSC)、十二烷基硫酸钠(SDS)洗10 分钟×2次，0.1×SSC、SDS洗15 分钟×2次后，按试剂盒说明书操作，进行免疫显色检测，出现颜色反应后，常规脱水、透明、封固，照相记录。

每次实验均设如下对照：阴性对照：(1)HSV感染的HF对照；(2)无标记探针的HCMV感染的新生乳鼠细胞培养物对照；(3)正常新生乳鼠脑神经细胞培养物对照。阳性对照：HCMV感染HF细胞培养物。

结果

1.HCMV感染神经胶质细胞病理变化：于已培养48小时的原代培养物中加入HCMV后，第3～4天即可观察到有少数神经胶质细胞变圆、肿胀；细胞出现明显病变常在感染后的第7天以后，主要表现为细胞肿胀变肥大、立体感和折光性均增强，并互相聚集在神经细胞周围(图1)。在感染后的第14～28天，还可观察到肿胀变大且具有“鱼眼”状特殊形态特征的圆形少突状胶质细胞。而同期感染的神经细胞出现明显易观察到的病变，一般约需10～14天。经HE染色，显示受染的神经胶质细胞体积明显增大，核增大偏移，胞浆宽广且呈嗜酸性。

图1HCMV感染神经胶质细胞体外1周活细胞培养物，光镜下直接观察。未染色<