【摘要】目的研究硬皮病成纤维细胞与纤连蛋白粘附，以及粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白在成纤维细胞表达原胶原mRNA中的作用。方法将硬皮病成纤维细胞置于纤连蛋白包被的培养体系中粘附培养，运用RT-PCR、免疫印迹法分别检测原胶原mRNA表达的变化及粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白；并观察阻断酪氨酸磷酸化后，原胶原mRNA和酪氨酸磷酸化蛋白的变化。结果硬皮病成纤维细胞与纤连蛋白粘附，可诱导相对分子质量为98000、65000酪氨酸磷酸化蛋白生成，且原胶原proα1(Ⅰ)mRNA的表达显著增加；经酪氨酸激酶抑制剂作用后，伴随着相对分子质量为98000、65000酪氨酸磷酸化蛋白的减少，原胶原proα1(Ⅰ)mRNA显著降低。结论成纤维细胞与纤连蛋白粘附，在硬皮病原胶原表达增加中具有重要作用，由粘附诱导的酪氨酸磷酸化是其中的一个重要环节。

Role of Adhesion Between Fibroblasts and Fibronectin and Tyrosine Phosphorylated Proteins Induced by the Adhesion on the Expression of

Procollagen in Scleroderma

HONG Wei, LIAO Wanqing, KONG Xiantao, et al

.Department of Dermatology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University,

Shanghai 200003

【Abstract】 Objective In order to investigate the role of adhesion between fibronectin and fibroblasts from scleroderma as well as tyrosine phosphorylated proteins induced by the adhesion on procollagen mRNA expression. Methods Fibroblasts from lesions of scleroderma were cultured in culture bottles absorbed with fibronectin. The levels of procollagen α1(I) mRNA and tyrosine phosphorylated proteins induced by the adhesion were detected by RT-PCR and immunoblotting, respectively. An inhibitor of tyrosine kinase, herbimycin A, was added to the medium to block the phosphorylation of tyrosine. The changes of procollagen mRNA and tyrosine phosphorylated proteins were further investigated. Results Adhesion between scleroderma fibroblasts and fibronectin not only induced the production of 98 000 and 65 000 tyrosine phosphorylated proteins, but also enhanced obviously the expression of procollagen α1(I) mRNA. When the phosphorylation of tyrosine was blocked, the level of procollagen α1(I) mRNA decreased significantly with the reduction of 98 000, 65 000 tyrosine phosphorylated proteins. Conclusion Adhesion between fibronectin and the fibroblasts plays an important role in enhanced expression of procollagen mRNA in scleroderma. Phosphorylation of tyrosine seems to be a key step in the process of expression of procollagen mRNA.

【Key words】 Scleroderma Fibroblasts Tyrosine phosphorylation

细胞外基质(ECM)－细胞间粘附作用在纤维化过程中具有重要意义，并且这种作用涉及到一系列细胞内信号转导过程，目前对于这方面的报道甚少。我们以硬皮病皮损成纤维细胞(FB)为靶细胞，将FB置于包被了纤连蛋白(Fn)的培养瓶中培养，检测粘附前后原胶原表达的变化以及Fn-FB粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白，并观察阻断酪氨酸磷酸化后，原胶原表达和酪氨酸磷酸化蛋白的变化，从而探讨粘附及其诱导的酪氨酸磷酸化蛋白在硬皮病FB原胶原基因表达中的作用。

材料和方法

一、材料

1.病例：硬皮病患者10例，为1995年9月至1996年11月在本院皮肤科就诊的患者，经临床及病理证实。其中男2例，女8例；年龄9～46岁，平均年龄28.2岁；病程2～16个月不等。

2.主要试剂：人血浆Fn、抑蛋白酶肽(牛胰Kunniz抑制剂)、苯甲酰磺酰氟(PMSF)均购于GibcoBRL公司；抗磷酸酪氨酸单抗、酪氨酸激酶抑制剂除莠霉素(herbimycinA)购于美国CalbiochemNovabiochem公司；Taq聚合酶购于宝灵曼公司；蛋白电泳低分子量Marker、PVDF膜及3mm滤纸购于华顺生物试剂公司。细胞悬浮缓冲液、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(8％分离胶、5％积层胶)、凝胶加样缓冲液、Tris－甘氨酸电泳缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液、转移缓冲液及DAB显色液配方参见《分子克隆》^[1]。

3.引物：由中国科学院生化所合成，PAGE纯化，其序列如下：proα1(Ⅰ)：5′-CCTGGCAAAGATGCACTC-3′，3′-GAAATTGTCTCCCATTTTTTTGGC-5′；GADPH：5′-GCAATCTGCATGTGTCTGTG-3′，3′-TTACCCAGGCTGAGTACTGCT-5′。

4.反转录试剂盒、LSAB组合试剂盒分别购于宝灵曼公司和Dako公司。

二、方法

1.硬皮病皮损FB的培养：采用组织块法培养，具体步骤参见文献[2]。

2.Fn-FB粘附：将Fn溶于DMEM，浓度为100μg/mL，加入培养瓶中使瓶底恰好铺满，4℃过夜，使用前PBS冲洗2次。将约2×106FB分别置于Fn包被的2个培养瓶内，5％CO₂孵箱孵育，1瓶30min后收集细胞提取蛋白，另1瓶6h后收集细胞提取RNA。

3.HerbimycinA对酪氨酸磷酸化的抑制：将2×106FB分别置Fn包被的2个培养瓶内，5％CO₂孵箱孵育15min后，加入100μmol/L除莠霉素A，5％CO₂孵箱继续孵育，1瓶30min后收集细胞提取蛋白；另1瓶继续孵育6h后收集细胞提取RNA。

4.蛋白质的提取及聚丙烯酰胺凝胶电泳：收集的细胞经PBS洗涤2遍后，加入5倍体积细胞悬浮缓冲液重悬细胞，再加入等体积2×SDS凝胶加样缓冲液，置沸水浴10min，立即以最大超声功率剪切DNA2min，离心10000r/min10min，吸取上清液，置－20℃保存备用。取等量蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(8％分离胶，5％积层胶)，详细步骤参见《分子克隆》。

5.免疫印迹检测酪氨酸磷酸化蛋白，采用电转移法，参照《分子克隆》所述电转移法步骤，将聚丙烯酰胺凝胶电泳产物转移至PVDF膜上(200mA电流电转移4h)，经丽春红S染色鉴定转膜成功后，将滤膜自然干燥，再用5％脱脂牛奶封闭，置分子杂交仪中室温2h；PBS洗后加入4mL抗磷酸酪氨酸单抗(2μg/mL)，再置分子杂交仪中室温2h；PBS洗后将膜置PBS中浸泡5min，2次；再加入4mL牛奶、1mLPBS及HRP－抗小鼠二抗(2μg/mL)，置分子杂交仪中室温2h；PBS洗后，将膜浸泡于PBS中5min，2次。最后加入新鲜配制的DAB显色液，避光显色，观察结果并拍照。

6.RT-PCR检测原胶原proα1(Ⅰ)mRNA：

(1)RNA的提取及反转录：提取RNA(参照《分子克隆》)，变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，紫外分光光度计定量。取RNA5μg，加入oligo(dT)1μL，DEPC处理水至体积12μL，依照GibcoBRL公司反转录试剂盒说明书进行反转录。

(2)PCRproα1(Ⅰ)及GADPH：取反转录产物cDNA2μL，引物以100μLTE溶解后，各取1μL，10×PCR缓冲液2μL，10mmol/LdNTP1μL，Taq酶2U，25mmol/LMgCL21.6μL(终浓度2.0mmol/L)，加水至终体积为20μL，混匀、离心，以矿物油覆盖，详见文献[2]。

7.计算机图象分析：RTPCR产物分析详见文献[2]。免疫印迹结果分析采用计算机图象分析计算面积灰度值。

8.统计学处理：配对计量资料的t检验。

结果

1.Fn-FB粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白：免疫印迹检测Fn-FB粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白，结果表明Fn-FB粘附可诱导生成相对分子质量为98000酪氨酸磷酸化蛋白(pp98)、pp65和pp40，未与Fn粘附的FB仅可检出pp40。如图1所示。

1：蛋白电泳Marker,2：未粘附组，3：纤连蛋白－成纤维细胞粘附组，

4：纤连蛋白－成纤维细胞－除莠霉素A组

1酪氨酸磷酸化蛋白的免疫印迹分析

2.Fn-FB粘附对FB原胶原proα1(Ⅰ)mRNA表达的影响：FB置包被Fn培养瓶内培养6h，RT-PCR检测FB原胶原proα(Ⅰ)mRNA水平(5.48±0.44)较未与Fn粘附组(2.86±0.77)显著增多(t=4.696,P＜0.01),图2。

1：DNAMarker:λ/EcRⅠ＋HindⅢ，2：未粘附组，3：纤连蛋白－成纤维细胞粘附组，4：纤连蛋白－成纤维细胞－除莠霉素A组

2RT-PCR检测原胶原proα1(Ⅰ)mRNA表达的电泳照

3.酪氨酸激酶抑制剂除莠霉素A对FB酪氨酸磷酸化的影响：FB在包被Fn培养瓶内与除莠霉素A共孵育30min，免疫印迹仅可检测到pp98，对其进行计算机灰度扫描量化，面积灰度值均数为9.87±0.93，较Fn-FB粘附组11.99±0.89显著减少(t=1.88,P＜0.05)