关键词： 脑脊髓炎；小神经胶质细胞；星形细胞；免疫组织化学

【摘要】目的确定小胶质细胞和星形胶质细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病及病变发展中的作用。方法用牛脊髓髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫豚鼠发生EAE，用免疫组化法观察EAE不同病期小胶质细胞和星形胶质细胞对炎性脱髓鞘病灶的反应。结果发生EAE的前3天，小胶质细胞即开始激活，在临床症状出现时其数量及激活程度达高峰，并持续至高峰期。恢复期数量逐渐减少，激活程度逐渐减弱。星形胶质细胞在症状高峰期开始激活并围绕在浸润细胞和病变血管周围，似有隔离小胶质细胞与病灶接触的作用，至恢复期激活明显。结论小胶质细胞激活在EAE的发病及进展中起重要作用，而星形胶质细胞主要与疾病的恢复有关。

Effects of microglia and astrocytes on inflammatory lesions of the central nervous system in experimental autoimmune encephalomyelitisYU Guoping, ZHU Ke, LIANG Xianyin, et al. Department of Neurology, Chinese PLA General Hospital, Beijing, 100853

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【Absteact】ObjectiveTo explore the role of microglia and astrocytes in the pathogenesis and lesion progress in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).MethodsWe induced EAE in guinea pigs using bovine MBP and examined microglial and astroglial reactions to EAE lesions at various stages with the method of immunohistochemistry. For the demonstration of the microglia and astrocytes, the antibodies against RCA-1 and glial fibrillary acidic protein (GFAP) were used.ResultsThe microglia began to become active three days before the appearance of clinical symptoms. At the initial stage of EAE, when the symptoms manifested themselves evidently the microglia were increased in number and in activity reaching their peaks in close association with the development of the lesions, whereas the astrocytes showed no significant reaction. At the peak stage of EAE, the astrocytes began to be active so that their fibers enclosed the inflammatory lesions. At the recovery stage of EAE, the astrocytes became significantly active, whereas the microglia reaction became gradually inactive and the microglia got slowly less and less in number.ConclusionIt is suggested that the the microglia augment, but the astrocytes suppress, the inflammatory processes in the CNS of EAE.

【Key words】 Encephalomyelitis Microglia Astrocytes Immunohistochemistry

近年来人们注意到，小胶质细胞作为中枢神经系统(CNS)中固有的免疫效应细胞参与其免疫反应^［1］，星形胶质细胞在CNS免疫反应中的作用也成为研究的热点。我们采用免疫组化法对多发性硬化(MS)的动物模型-实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)CNS中小胶质细胞和星形胶质细胞的形态学作了动态观察。

材料和方法

1.实验动物：二级雌性Hartley豚鼠36只(购自中国医学科学院动物中心)，6周龄，体重180～230 g，随机分为6组，分别为实验1～5组和对照组，每组6只。

2.EAE的诱发：实验组用牛脊髓髓鞘碱性蛋白(MBP)加完全福氏佐剂(CFA)免疫，MBP和CFA充分乳化后注射于右后足蹼皮下，每只注射MBP 100 μg。对照组注射等量生理盐水加CFA。

3.抗体：采用抗蓖麻凝集素(ricinus communis agglutinin,RCA)-1(Vector)标记小胶质细胞，抗体1∶300稀释；抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)多克隆抗体(DAKO)标记星形胶质细胞，抗体1∶100稀释。

4.实验方法：预实验发现EAE豚鼠平均发病时间为免疫后第8天，为观察小胶质细胞和星形胶质细胞在EAE临床发病前的变化，观察时间确定如下：实验1组为免疫后第3天；实验2组为免疫后第5天；实验3组为发病第1天(初期)，实验4组为发病第5天(高峰期)，实验5组为发病后2周(恢复期)。

标本采集：动物用质量浓度为0.1的水合氯醛(400 mg/kg体重)麻醉后，立即暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，然后快速灌注肝素化生理盐水150 ml，随后灌注0.1 mol/L磷酸盐缓冲液800 ml，灌注时间约1小时。最后取脑和脊髓置质量浓度为0.2蔗糖(0.1 mol/L磷酸盐缓冲液)中保存。

5.免疫组化染色：全脑及胸腰段脊髓标本采用Leica冷冻切片机切片，厚度50 μm，每隔250 μm切片1张。采用免疫组化ABC漂染法染色，其中抗RCA-1标记小胶质细胞时不需加入生物素标记的抗兔 IgG。用镍-3′3-二胺基联苯胺(DAB)-葡萄糖氧化酶显色系统显色；用质量浓度为0.01的明胶贴片，晾干后梯度酒精脱水、二甲苯透明，封片胶封片观察。

显色液配制：0.1 mol/L (pH5.8)醋酸缓冲液100 ml加入硫酸镍胺4 g、葡萄糖200 mg、氯化氨40 mg、DAB 50 mg(Sigma)，过滤后，加葡萄糖氧化酶0.8 mg (Sigma)。

结果

用生理盐水加CFA免疫的对照组均未发病，实验3～5组每组的发病数为4～6只，潜伏期8天左右，潜伏期短者，病情较重。多数动物发病第1天出现双后肢轻度无力、行动迟缓；第2、3天后肢无力明显加重并出现双前肢无力、尿失禁；第4～6天病情达高峰，四肢瘫痪、不进食、体重明显下降，部分出现全身震颤或意识障碍；第8天后动物开始逐渐恢复。

正常和病理条件下，小胶质细胞的识别是根据它们的形态学及抗RCA-1免疫组化结果^［2］。小胶质细胞在正常的豚鼠CNS中，显示抗RCA-1免疫反应阳性。在某些病理条件下，由于CNS中有血源性巨噬细胞浸润，而这些血源性巨噬细胞也呈现RCA-1阳性，这时就需要根据它们的形态学来鉴别，有树突的RCA-1阳性细胞是小胶质细胞，而圆形或卵圆形的 RCA-1阳性细胞是骨髓衍化的巨噬细胞。

在正常的脊髓，RCA-1阳性细胞均匀地分布在灰质和白质中(图1)，在免疫后第5天白质中的小胶质细胞开始激活，胞体轻度变大，数量较正常增多(图2)。发病初期小胶质细胞激活达高峰，胞体明显增大，树突不明显，可见灶性分布，在部分白质中，虽无明显的小胶质细胞呈灶性聚集，但可见大量明显激活的小胶质细胞，这种小胶质细胞的激活一直持续到EAE的临床高峰期(图3)。EAE恢复期的小胶质细胞数量开始减少，并再次显示“树突”状，与抗GFAP免疫反应阳性的星形胶质细胞并存。

图1对照组豚鼠脊髓可见散在的小胶质细胞分布。

抗RCA-1免疫组化染色×300

图2EAE临床症状出现前3天，脊髓白质血管周围小胶质细胞开始激活，胞体变大。

抗RCA-1免疫组化染色×300

图3EAE发病高峰期激活的小胶质细胞围绕病灶及血管。

抗RCA-1免疫组化染色×300

星形胶质细胞发生EAE的病灶反应较小胶质细胞晚。在正常的脊髓白质，星形胶质细胞的树突呈向心性排列，胞体不明显(图4)。在EAE发病前及发病早期，GFAP阳性星形胶质细胞与正常的脊髓所见基本相同，只是部分树突呈波浪状。但在EAE高峰期，星形胶质细胞开始反应，部分浸润的炎细胞和小血管被星形胶质细胞的突起围绕(图5)。 EAE恢复期星形胶质细胞反应最明显(图6)，部分病灶形成胶质瘢痕。

图4对照组脊髓星形胶质细胞胞体不明显，树突呈向心状平行排列。

抗GFAP免疫组化染色×300

图5EAE临床高峰期，脊髓白质中星形胶质细胞胞体开始增大，

树突有围绕病变血管之趋势。

抗GFAP免疫组化染色×300

图6EAE恢复期，脊髓白质中部分血管周围星形胶质细胞反应明显。

抗GFAP免疫组化染色×200

讨论

CNS胶质细胞增生和