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材料和方法：雄性纯种SHR 37只，体重350～400 g，随机分成正常组、假手术对照组和脑缺血后1、4、12、24及48小时组。按Longa的方法，用尼龙丝线大脑中动脉栓塞，建立MCAO局灶脑缺血模型。按Chomczyki一步法抽提RNA。引物序列及扩增长度如下：cNOS:5′GCCGGATCCTCCAGGAGGGTGTCCACCGCAT-G3′，5′CCGGAATTCGAATACCAGCCTGAT-CCATGGAA3′，扩增产物614 bp；iNOS:5′GTGTTCCACCAGGAGATGTTG3′，5′CTCCTGCCCACTGAGTTCCGTTC3′，扩增产物576 bp；β-actin： 5′GTGGGCCGCTCTAGGCAC-CAA3′，5′CTCTTTGATGTCACGCACGAT-TTC3′，扩增产物540 bp。逆转录反应：75℃变性5分钟，然后，37℃水浴45分钟，95℃变性5分钟，保存于-20℃备用。PCR反应条件：逆转录反应产物在94℃变性5分钟，然后按以下条件：cNOS 94℃ 1分钟，68℃ 1分钟，72℃ 2.5分钟，循环35次。反应结束前72℃ 20分钟；iNOS 94℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 2.5分钟，循环35次。反应结束前72℃ 20分钟；β-actin 94℃ 1分钟，54℃ 40秒，72℃ 40秒，循环35次，反应结束前72℃ 20分钟，产物保存于-20℃。PCR产物电泳鉴定，通过β-actin校正，半定量计算cNOS、iNOS含量。统计学用t检验、ANOVA、Duncan检验。
结果：脑缺血后脑组织中cNOS mRNA在1、4小时表达增加，12小时后cNOS mRNA表达开始下降，24小时后cNOS mRNA表达明显下降，直至48小时(P＜0.01)。脑缺血后1小时、4小时脑组织中iNOS mRNA表达轻度升高，但与对照组比较，差异无显著意义(P＞0.05),12小时iNOS mRNA表达开始升高，24、48小时后iNOS mRN表达明显增加(P＜0.01)。
讨论：通常观察NO系统作用的方法不能区别三种NOS，不能回答何种NOS在发挥作用。我们采用灵敏度较高的RT-PCR技术，同时观察cNOS、iNOS mRNA在SHR MCAO局灶脑缺血模型中的不同表达，从而有助于研究NO在脑缺血不同时期中的作用。本组结果提示，在脑缺血早期以cNOS的作用为主，而在脑缺血的中晚期iNOS起主要作用。脑缺血早期，某些因子激活内皮细胞和神经元等表达cNOS，由此合成的NO通过NO-GC-cGMP途径，对脑组织起保护作用；脑缺血中晚期，梗死灶内出现的炎性细胞、巨噬细胞可诱导iNOS，由其合成的NO对缺血脑组织可能造成损害。
本课题为卫生部脑缺血基因资助项目
(收稿：1998-05-28修回：1999-01-08)
