关键词： 白细胞介素1；谷氨酸；钙；神经元

【摘要】目的研究白细胞介素1β(IL-1β)促进癫痫发作和神经细胞损伤的细胞内机制。方法应用EPC-9光电联合检测系统检测IL-1β对培养海马神经元单个细胞内游离钙离子(［Ca²⁺］i)浓度的影响，以及IL-1β与谷氨酸(Glu)共同作用对神经元［Ca²⁺］i浓度的影响。结果不同浓度的IL-1β(5、10、20、30、50及100 U/ml)均不能引起神经元［Ca²⁺］i浓度的显著变化，而IL-1β却能剂量依赖性地促进Glu对神经元［Ca²⁺］i浓度的升高作用。MK-801抑制了Glu的升钙作用，也抑制了IL-1β对Glu升钙的促进作用，而verapamil对Glu和IL-1β的作用均无明显影响。结论IL-1β作为一种神经调质，促进Glu激活N-甲基-D天门冬氨酸（NMDA）受体，并介导细胞内游离钙离子浓度增高，提高神经细胞的兴奋性。

Effect of interleukin-1β on the augmentation of cytoplasmic free calcium concentration of cultured hippocampal neurons induced by L-glutamate WANG Yu, RUAN Xuzhong, ZHANG Suming, et al. *Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical University， Wuhan 430030

【Abstract】ObjectiveTo investigate the intracellular mechanism that interleukin-1β(IL-1β) facilitates epileptic seizure and neuronal damage.MethodThe effect of IL-1β alone or IL-1β cooperated with glutamate (Glu) on the intracellular free calcium concentration (［Ca²⁺］i) of single cultured hippocampal neuron was examined, via EPC-9 light-electricity measurement system.ResultsVarial concentrations of IL-1β (5、10、20、30、50、100 U/ml) failed to affect the neuronal［Ca²⁺］i, but IL-1β could dose-dependently facilitate the augmentation of neuronal［Ca²⁺］i induced by Glu. MK-801 inhibited the effect of Glu on ［Ca²⁺］i, and also inhibited the effect of IL-1βon ［Ca²⁺］i induced by Glu . But verapamil did not influence the effect of Glu or IL-1β.Conclusion IL-1β, as a neuromodulator, facilitates the activation of NMDA receptor by Glu, inducing the increase of intracellular calcium, which makes neuron more excited.

【Key words】 Interleukin-1 glutamic acid Calcium Neurons

神经系统和免疫系统之间存在着复杂的网络调控机制，白细胞介素1(IL-1)作为一种重要的细胞因子，在中枢神经系统(CNS)中主要由胶质细胞分泌，广泛分布于中枢神经系统的各个部位，它不仅参与神经系统的生长、发育及多种生理活动的调节，而且与一些神经系统疾病，如癫痫、缺血性脑损伤、Alzheimer病及多发性硬化等退行性疾病密切相关，有促进神经损伤的作用^［1,2］。但其促进神经细胞损伤的机制目前仍不清楚。我们拟通过EPC-9光电联合检测系统检测IL-1β对单个细胞［Ca²⁺］i浓度的影响，同时我们还将首次研究IL-1β与谷氨酸(Glu)共同作用对神经元［Ca²⁺］i浓度的影响。本检测系统避免了检测细胞悬液时由于细胞死亡、细胞分散不好以及Fura-2泄露造成的误差。

材料与方法

一、试剂和仪器

DMEM/F12培养基、胎牛血清、小牛血清均购自Gibco公司，胰蛋白酶(上海化学试剂厂)，Fura-2/AM、MK-801、IL-1β购于Sigma公司，余为国产分析纯试剂，Diapho-TMD型荧光倒置显微镜为日本Nikon公司产品，Shel Lab 2300型二氧化碳培养箱。

二、神经细胞培养

取5天内新生SD大鼠30只，消毒取脑并去脑膜，无菌Hank液冲洗后分离海马并剪碎，经0.25%的胰蛋白酶37℃消化10分钟，镜下观察细胞。当连接变透明后，用冷Hank液终止消化，用20 μm筛过后，收集滤液离心(1 000 r/min,10分钟)，吸弃上清，沉淀。用1 ml培养基稀释、悬浮细胞，采用沙利白细胞计数板计数，算出细胞总数。稀释于完全培养基(DMEM/F12 84%、胎牛血清5%、小牛血清10%及链霉素1%)，以1×10⁵～10⁶/ml密度接种于24孔细胞培养板中(板中预先放置小盖玻片并涂L-poly-lysine)。将培养板置于二氧化碳培养箱中，在37℃、5%二氧化碳及95%氧气条件下培养。第7天可见典型的神经细胞，此时取出培养板中的小盖玻片，用无镁的Hank液清洗2次待用。

三、细胞内［Ca²⁺］i浓度测定

应用5 μmol/L Fura-2/AM孵育小盖片，37℃，40分钟。孵育后的小盖片用无镁的Hank液清洗2次后，再将小盖片放入含有1 ml无镁Hank液中，在光电联合检测系统上检测单个神经元的［Ca²⁺］i。激发光波长340 nm和380 nm，发射波长505 nm，测定温度20℃。采用微电极给药方式，将所需浓度的条件液直接加到所测定的单个神经元的周围。由下式计算出胞浆［Ca²⁺］i浓度。［Ca²⁺］i=Kd×(Fd/Fs)×［(R-Rmin)/(Rmax-R)］。式中R为实验观察到的荧光比值(F340/F380)，Kd是Fura-2与钙离子反应的解离常数，生理条件下Kd值为224 nmol/L，Rmax为胞内Fura-2全部被钙离子饱和时的荧光比值，Rmin为Fura-2未完全结合钙离子时的荧光比值，Fd、Fs分别表示无钙离子和钙离子饱和状态下380 nm波长处的荧光强度。在没有加Fura-2时测定细胞的自发荧光，计算钙离子之前须减去细胞的自发荧光与背景荧光，根据荧光比值，由计算机自动处理计算出［Ca²⁺］i浓度。

所有数据进行t检验。

结果

一、IL-1β对培养神经元单细胞胞浆［Ca²⁺］i浓度的影响

神经元胞浆［Ca²⁺］i的基础水平为（0.53±0.19）μmol/L，不同浓度IL-1β (5、10、20、30、50及100U/ml)作用于神经元后30分钟内，均未引起神经元［Ca²⁺］i浓度的显著变化(P＞0.05)。30 U/ml和50 U/ml浓度的IL-1β 5～10分钟后可引起神经元［Ca²⁺］i浓度轻度增高，但与基础［Ca²⁺］i浓度比较，差异无显著意义(P＞0.05)。

二、不同浓度IL-1β对Glu诱导的培养海马神经元［Ca²⁺］i浓度的影响

50 μmol/L Glu作用于神经元后，胞浆［Ca²⁺］i浓度迅速上升，平均为（2.08±0.21） μmol/L，较基础［Ca²⁺］i浓度(0.53±0.19) μmol/L显著升高(P＜0.01)。当在Glu作用于神经元之前，向测定介质中加入不同浓度的IL-1β孵育神经元5分钟后，再加入Glu,可见Glu的升钙作用在加入10～100U/ml IL-1β后明显加强(P＜0.05，P＜0.01)，并呈剂量依赖性，而5 U/ml的IL-1β则无促进Glu的升钙作用。预先加入IL-1受体拮抗剂IL-1rα(1 mg/L)，则完全阻断IL-1β(30 U/ml)对Glu升高［Ca²⁺］i浓度的促进作用。

三、verapamil和MK-801对IL-1β促Glu升高神经细胞内［Ca²⁺］i浓度的影响

预先向介质中加入的verapamil(10 μmol/L)对其后加入的Glu(50μmol/L)或IL-1β (30 U/ml)+Glu (50 μmol/L)的升钙作用均无显著影响(P＞0.05)；而预先加入的MK-801(10 μmol/L)则对其后加入的IL-1β (30 U/ml)+ Glu (50 μmol/L)的升钙抑制作用接近基础［Ca²⁺］i水平(P＜0.01)，且与预先加入MK-801后直接加入Glu (50 μmol/L)后测得的神经元［Ca²⁺］i浓度比较，差异无显著意义(P＞0.05)。

讨论

正常状态下，真核细胞内［Ca²⁺］i浓度仅在0.1～10.0 μmol/L范围内，而细胞外浓度为0.1～10.0 mmol/L，细胞内钙比细胞外钙低10⁴～10⁵倍。此细胞内外钙离子高浓度差的存在是其进行正常生理活动的基础。生理状态下，细胞内外钙离子存在功能稳态，此稳态破坏，细胞就会发生功能及器质性损害，乃至死亡^［3］。与Glu兴奋毒性损害密切相关的疾病如癫痫、缺血性脑血管病，其重要机制系谷氨酸激活NMDA受体触发过度钙离子内流，从而触发一系列酶的激活，导致细胞死亡，钙离子的过度内流在癫痫发病中的作用亦已受到广泛的关注。

本研究结果显示，IL-1β可明显促进Glu的升钙作用，并在所用的剂量范围内(10～100 U/ml)呈明显的剂量依赖性。而IL-1β单独加入待测神经元所在介质中，则对细胞［Ca²⁺］i浓度无明显影响，推测IL-1β在此起到一种神经调质的作用。有作者报道IL-1β能增强NMDA受体与其配体的结合力^［4］。从另一个角度看，IL-1β作用于神经元后，只有在向介质中加入Glu(相当于癫痫、缺血性脑血管病脑组织中Glu病理性升高)才能体现IL-1β的作用。许多研究结果亦显示，IL-1本身对健康脑组织或正常神经细胞并无毒性，但可显著增强兴奋性和缺血性脑损害^［1,5］，二者可能存在某种机制上的吻合。IL-1可促进NMDA受体激活所产生的神经细胞死亡，而IL-1ra则有抑制神经细胞兴奋毒作用^［5］。本研究过程中亦发现，IL-1ra能完全阻断IL-1β对谷氨酸诱导胞内钙离子增高的促进作用。因此，IL-1的促兴奋作用可能与其促进谷氨