关键词： 帕金森病；脑源性神经生长因子；基因疗法

【摘要】目的观察脑源性神经营养因子（BDNF）基因工程成肌细胞脑内纹状体移植对帕金森病大鼠的治疗作用。方法建立逆转录病毒介导的BDNF表达质粒并转染成肌细胞，筛选阳性细胞进行脑内移植。结果基因工程成肌细胞脑内移植可明显提高帕金森病大鼠黑质酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元的存活率，使纹状体多巴胺含量明显增加，动物的旋转行为改善约50%，并持续2个月之久。结论脑源性神经营养因子基因工程成肌细胞脑内纹状体移植可明显改善动物的旋转行为并可促进黑质神经原的存活，为帕金森病的治疗提供了一种新的有效的治疗方法。

Grafting myoblasts genetically engineered to produce BDNF in rats Parkinson disease modelsQU Shen, HE Xiaolong, HE Cheng, et al. Department of Neurobiology, The Second Military Medical University, Shanghai 200433.

【Abstract】ObjectiveTo observe the role of genetically engineered myoblast in the treatment of rat Parkinson disease models.Methods Genetically modified myoblasts to produce brain derived neurotrophic factors (BDNF) were established and grafted into the corpora striata of Parkinson disease modelsin rats. The behavior and pathological changes were observed and the Dopamine contents in the corbora striata were measured with high performance liquid chromatography (HPLC).ResultsThe intracranial graft of genetically engineered myoblasts can promote the survival of TH-positive neurons in the nigra of Parkinson's rat and the content of Dopamine in the striatum were increased significantly. The rotation behavior improved 50% after the transplantation.Conclusion It is suggested that BDNF secreting myoblasts can promote the survival of the neuron and provide a new and effective method for the treatment of Parkinson disease.

【Key words】Brain-derived neurotrophic factor Parkinson disease Gene therapy

帕金森病(PD)是一种神经系统退行性疾病，严重影响到患者的健康和生存能力，主要表现为黑质多巴胺能神经元的丧失，纹状体多巴胺含量严重下降，临床上以震颤、强直、运动迟缓为主要表现。至今尚无有效的药物能阻止神经元的变性，使病情逆转。脑源性神经生长因子能特异性的促进脑内多巴胺能神经元的存活，保护神经元免受神经毒性的作用，为帕金森病的治疗带来了希望。

血脑屏障的存在使常规的给药方式受到了限制，而帕金森病缓慢进展的病情又需要反复长期给药，基因治疗的出现为此提供了可能，本研究拟通过脑源性神经营养因子(BDNF)基因工程细胞脑内移植在脑内缓慢释放神经营养因子，在帕金森病大鼠中起到治疗作用。

材料和方法

一、BDNF基因工程细胞的构建与筛选

将EcoR1酶切下的BDNFcDNA经酶切，补平，去磷酸化，平端连接于双拷贝逆转录病毒载体PN₂A，电泳，酶切鉴定为正向连接，电穿孔法转染PA317包装细胞，根据其携带的neo基因采用G418筛选转染阳性克隆，选取高滴度的病毒上清感染成肌细胞L-6TG，G418 400 μg/ml约2周后筛选出阳性细胞株，命名为BDNF（+）/L-6TG细胞。

二、BDNF（+）/L-6TG细胞BDNFmRNA的表达及生物学活性测定

采用地高辛标记BDNF探针Northern杂交证实转基因细胞内有BDNFmRNA的表达，且基因工程细胞分泌上清能促进PC12突起生长和细胞存活，证实其具BDNF的体外生物学活性。

三、6-羟基多巴胺(6-OHDA)毁损制备PD大鼠模型

参照Ungerstedt^［1］等方法，雄性SD大鼠200～220 g，2%戊巴比妥钠麻醉后黑质致密区定位注射（前囟后5.0 mm,旁开2.0 mm,硬膜下7.5 mm），微量注射器缓慢注入6-OHDA，每只4 μl（2 μg/μl），3天后阿朴吗啡腹腔内注射诱导大鼠的旋转行为，选取＞10转/分钟的大鼠为PD模型成功大鼠，120只大鼠中共制备得32只PD模型，实验组和对照组各13只，PD组6只，分别于1周后行细胞移植。

四、基因工程细胞脑内移植

培养几近融合细胞，胰酶消化后悬浮于磷酸缓冲液(PBS)中，细胞计数后进行纹状体移植（前囟前1.0 mm,旁开2.5 mm,硬膜下4.5 mm），每只4 μl，细胞浓度10⁴/μl，对照组为L-6TG细胞脑内移植。

五、疗效观察

1.行为学观察：细胞移植后2、4、8周进行阿朴吗啡诱导，观察动物的旋转行为。

2.形态学观察：对各期动物进行脑内灌注，多聚甲醛固定，冰冻切片，片厚15 μm，每个标本同一平面顺切4张切片进行黑质尼氏染色和TH免疫组化染色，用中科院通用颗粒分析系统软件对尼氏染色和酪氨酸染色阳性神经原进行计数和面积测定。

3.脑内纹状体多巴胺含量测定：不同阶段实验大鼠断头取脑，冰上分离纹状体，置-70℃冰箱待测。测定时称重匀浆，应用高压液相电化学检测器进行多巴胺含量测定。色谱条件：色谱柱25.0 cm、4.6 mm,颗粒度5。流动相：NaH₂PO₄2H₂O,辛烷磺酸钠，EDTA2Na，乙晴。用0.2 μm纤维素脂膜过滤，质量分数为0.85的磷酸调pH至3.5，流速1.0 ml/min，电化学检测器检测电压0.65 V，参比电极Ag/AgCl,灵敏度3 2Nf/mV，进样100μl。标准品倍比稀释，作稀释曲线。

六、统计学处理

所有数据以均数±标准误表示，统计方法为小样本均数t检验和多样本均数方差分析。

结果

一、行为学观察

阿朴吗啡诱导的大鼠旋转行为测定显示基因工程细胞移植组大鼠的旋转行为在细胞移植2周后减少50%，且可持续2个月之久，而PD组和与成肌细胞移植对照组旋转行为无明显改变，统计学处理相差非常显著。

二、形态学观察

1.尼氏染色：黑质尼氏染色显示毁损侧神经元较之健侧在各期均明显减少，三组毁损侧相比，神经元存活数和存活率基因工程细胞移植组与对照组和帕金森组比较均明显提高，细胞数在2周后分别为453.3±65.2、365.5±95.6和288.3±44.0,存活率分别为(68.8±10.1)%、(47.2±4.1)%和(52.5±3.7)%,统计学处理显示实验组和对照组及PD组均相差显著。

2.TH免疫组化：黑质TH免疫组化显示，三组中毁损侧TH阳性神经元存活较之健侧在各时程均有差异，实验组、对照组和PD组在细胞移植2周后的细胞数分别为80.5±23.8，37.5±16.7和32.5±19.7,与健侧相比的存活率分别为(50.7±11.4)%、(29.7±5.9)%和(20.7±7.7)%。基因工程细胞移植组毁损侧神经元存活数和存活率较之对照组和帕金森组均明显提高，统计学处理相差极为显著。

3.细胞移植后各期纹状体多巴胺含量：高效液相测定显示各组毁损侧纹状体多巴胺含量较之健侧均明显降低，移植组毁损侧多巴胺含量与对照组相比在各期均有明显升高，移植组毁损侧多巴胺含量为健侧的51.0%，而对照组毁损侧的多巴胺含量仅为健侧的17.0%，经统计学处理相差非常显著(P＜0.01)。

讨论

帕金森病基因治疗的研究目前主要集中在两个方面：一个是以补充多巴胺的不足为目的，即先前的多巴胺和酪氨酸羟化酶（TH）的转基因治疗，TH是多巴胺合成中的限速酶，与脑内多巴胺含量有明显关系。国外Wolff等^［2］和国内赵迎春等^［3］进行了TH基因工程细胞大鼠纹状体脑内移植的研究，发现可改善动物的旋转行为，TH阳性细胞存活增加，并可持续表达至数月之久。这些结果都表明TH基因脑内移植对帕金森病有治疗作用。另一种方法是以挽救幸存神经原为目的的基因治疗，即神经营养因子的基因治疗研究。

近年来，BDNF对多巴胺神经元的特异性作用引起了人们的关注，其体内外作用已得到了深入的研究^［4，5］，体内BDNF对多巴胺神经元的保护作用已有大量证据，而其治疗作用却鲜有报道。David等^［6］将BDNF基因工程成纤维细胞提前移植于1-甲基-4-苯-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)毁损的帕金森大鼠纹状体，可防治1-甲基-4-苯基吡啶(MPP)对大鼠的毒性作用，黑质TH阳性细胞较之对照组明显增加，说明其具有保护黑质多巴胺能神经元的作用，这可能是通过逆轴突转运诱导细胞的保护机制或增加线粒体的功能发挥作用。本研究选择了6-OHDA特异性毁损黑质多巴胺能神经元制备帕金森症动物模型来研究BDNF对帕金森症的治疗作用。结果发现，在给予细胞移植后，动物的旋转行为明显减少并持续了2个月之久，与对照组相比，相差非常显著，个别动物旋转行为完全消失。毁损侧纹状体多巴胺含量与对照组相比亦有明显升高，分别为50%与16%，与David等研究相吻合。同时我们对不同治疗阶段鼠脑冰冻切片，进行尼氏染色和TH免疫组化研究，发现毁损侧黑质尼氏染色和酪氨酸羟化酶阳性神经元与对侧相比均显著减少，移植组细胞存活数和存活率与对照组、PD组相比均明显增加，在各期均相差非常显