关键词： 疱疹病毒性脑炎；疱疹病毒；活检；脑；早期诊断

【摘要】目的探讨不同检测手段对早期诊断疱疹病毒性脑炎(HVE)的价值。方法应用间接荧光抗体法(IFA)、聚合酶链反应(PCR)检测HVE患者脑脊液中的抗疱疹病毒IgM抗体和疱疹病毒核酸；应用免疫细胞化学(ICC)、原位杂交(ISH)和PCR检测HVE患者脑活检组织中的疱疹病毒抗原和核酸。结果64例患者脑脊液中54例抗疱疹病毒IgM抗体阳性，50例PCR阳性，其中40例两者均为阳性。12例脑组织中10例PCR阳性，4例ISH阳性，6例ICC阳性。结论抗疱疹病毒IgM抗体检测最敏感，以下依次为PCR、ICC、ISH诊断疱疹病毒性脑炎，联合应用以上几种检测手段有助于提高早期诊断HVE阳性率。

Early diagnosis of herpes viral encephalitisXiao Bo^*, Hou Xide, Xiang chuanxi, et al. *Department of Neurology, Xiang Ya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008

【Abstract】ObjectiveTo study the value of different methods for the early diagnosis of herpes viral encephalitis (HVE).Methods With indirect fluorescent antibody assay (IFA), polymerase chain reaction (PCR), to detect viral antibody and DNA in cerebral spinal fluid (CSF), and with immunocytochemistry(ICC) and in situ hybridization (ISH), to detect viral antigen and DNA in the brain biopsy tissues.ResultsAmong 64 CSF samples, 54 samples were positive with immunosluofescence assay(IFA), and 50 with PCR; 40 samples were positive with both methods. 10 samples were positive with PCR, 4 with ISH, and 6 with ICC from 12 brain biopsy samples. ConclusionsIgM detection was the most sensitive to early diagnosis of HVE, and in the following order of sensitivity were pCR, ICC and ISH. Combining these methods were of use to improve the positive rate of early diagnosis of HVE.

【Key word】Herpes viral encephalitisHerpes virusBrain biopsyEarly diagnosis

已有的研究表明，疱疹病毒是导致疱疹病毒性脑炎(HVE)的常见病原体，包括单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)等^［1，2］。由于相当多病例发病早期临床表现不典型，容易误诊、漏诊、延误治疗，导致病人死亡或残废，因而早期诊断成为降低该类疾病死亡率和残废率的关键。我们试通过对脑脊液中抗疱疹病毒抗体、病毒核酸及脑活检标本的病毒抗原和核酸的检测，探讨早期、快速诊断HVE各方法的价值。

资料和方法

一、一般资料

本组共64例，其中男34例，女30例；年龄11～52岁，其中＜20岁35例，20～50岁23例，＞50岁6例。全年发病，无明显季节性。病前上呼吸道感染者41例，受凉7例，过度劳累3例，产后4例，其余9例无明确诱因。首发症状以精神障碍为主42例，高热伴惊厥10例，抽搐4例，昏迷5例，偏瘫3例，其他症状包括呕吐、视力下降、脑膜刺激征等。脑脊液检查发现56例在起病1周内均有异常，白细胞(26～600)×10⁶/L，蛋白0.5～1.5 g/L，糖和氯化物正常。其中14例有红细胞，11例黄变。另8例病后2周，脑脊液未发现异常。脑电图发现50例在病程早期表现为弥漫性慢波活动的背景上出现局灶性尖波、棘波，以颞叶明显，也可见于额叶。

二、脑脊液的病毒抗体和病毒核酸检测

64例患者在病后10天内取脑脊液做以下检查。

1.间接荧光抗体法(IFA)：应用IFA检测脑脊液中HSV、CMV、EBV IgM抗体，按王得新等^［3］介绍的方法检测和判断IgM抗体的阳性或阴性。

2.聚合酶链反应(PCR)：应用PCR检测脑脊液中病毒核酸。模板DNA抽提按金庆文等^［4］介绍的方法进行，扩增在MJ PTC-100^TM程序性温控器上实施。反应试剂盒为上海复星高科技有限公司产品，总反应体积20 μl，93℃预变性5分钟后按变性93℃45秒、复性55℃45秒、延伸72℃60秒3个循环步骤扩增，循环35次。末次循环在复性后72℃延伸5分钟，同时做阴性和阳性对照。

三、脑组织的病毒抗原和核酸检测

上述64例病人中的12例患者在局麻下取右额叶脑组织作以下3种检查。

1.免疫细胞化学(ICC)：应用SP法检测3种病毒的抗原。抗HSV-Ⅰ型抗体和抗CMV抗体为DAKO公司产品，抗EB病毒抗体、阳性对照和SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司，按常规SP法操作。

2.原位杂交(ISH)：ISH的生物素标记的HSV cDNA探针诊断试剂盒购自美国ENDO BIOCHEM公司，EBV cDNA探针试剂盒由GBI生物技术(北京)有限公司提供，CMV cDNA探针为意大利Francesco Pisani教授赠送。操作按向传喜等^［5］介绍的方法进行。

3.PCR：用于脑组织PCR试剂来源同脑脊液PCR法。取8 μm厚的组织切片5张，装入1.5 ml的Eppendorf管中，每管中加入1 ml TE液(10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 1 mmol/L EDTA)。置72℃水浴10分钟，插入吸水滤纸条，将浮蜡及TE吸干，反复数次，直至石蜡除净，然后按常规操作进行PCR扩增。

结果

结果

一、脑脊液的病毒抗体和PCR检测

64例标本中38例HSV-Ⅰ IgM阳性；12例CMV IgM阳性；4例EBV IgM阳性。PCR检测到36例HSV-Ⅰ DNA阳性，10例CMV DNA阳性和4例EBV DNA阳性。其中40例IgM和PCR均为阳性。

二、脑组织的ICC、ISH和PCR检测

12例脑组织标本中4例ICC发现HSV抗原(图1)。4例ISH检测到HSV-Ⅰ DNA(图2)，7例PCR检测到HSV-Ⅰ DNA。其中3例上述3种方法均为阳性，总计3种方法共检出9例HSV抗原或(和)病毒核酸阳性。除ISH检测的1例标本是起病第38天活检外，其余标本均在起病10天内采集。应用ICC仅检测到2例CMV阳性，PCR发现3例阳性，ICC阳性者PCR亦为阳性，ISH未发现异常。用上述3种方法均未发现EBV抗原或抗酸。

讨论

疱疹病毒性脑炎预后较差，早期诊断是治疗成功的关键。目前常用的实验方法主要包括检测机体对病毒的反应产物抗体，测定病毒的基因组或抗原，从脑组织或脑脊液中分离病毒。后者虽被认为是诊断病毒性脑炎最可靠的方法之一，但费时较久，且阳性率低，不适宜早期快速诊断，已很少用于临床。一般认为IgG在脑脊液中出现较晚，约在发病2周之后，故对早期诊断帮助不大。IgM则相反，起病早期则可在脑脊液或血液中出现。本组6例在起病2天后即发现IgM增高，与文献报道类似^［6］，其余病例大多在起病10天内有阳性结果，符合早期、快速诊断的要求。

利用特异性抗体直接检测脑组织中的病毒抗原，是另一早期诊断病毒性脑炎的方法之一。因为病毒抗原在脑组织内存在的时间较短，仅出现在急性期，起病3周后则很难发现^［7］。本组所检测的病毒抗原全部是急性感染病例，病毒抗原主要存在于炎症组织周围的神经细胞、小胶质细胞和巨噬细胞内，偶见于星形胶质细胞的胞核和胞浆中。在确定病毒成分在细胞内的定位方面，ISH同ICC有类似之处，只是ISH确定的是病毒核酸而已。与病毒抗原不同的是，病毒核酸的分布局限于胞核，胞浆中几乎检测不到，这与病毒核酸只在核内复制有关。除了在急性期用ISH检测到病毒核酸外，亚急性起病病程长达1个月以上的患者脑组织中也发现病毒核酸，与Manfred等^［8］的观察一致，提示ISH不仅可用于早期诊断，而且还可帮助确定亚急性和潜伏感染病例。

与ISH相比，PCR检测脑组织中的病毒核酸更为敏感。特别是在疾病早期，病毒量少，用其他方法往往难于检测，而PCR就有可能通过扩增检测到微量的病毒核酸。本组12例脑活检组织中10例用PCR检测出病毒核酸，用ISH仅发现4例。Boerman等^［9］比较了PCR、常规病毒培养、免疫荧光和斑点杂交4种方法对实验性单纯疱疹病毒脑炎鼠脑脊液中HSV和HSV DNA检测敏感性，结果表明，上述4种方法的阳性率分别为68.0％、55.0％、20.0％和2.5%，显而易见，PCR优于其他3种方法。由于病毒主要侵犯脑实质，进入脑脊液的只有极少部分，故直接检测脑组织的病毒核酸阳性率更高。

较多的文献认为CMV脑炎主要见于肾移植或艾滋病(AIDS)病患者^{［10，11］}，但也有作者报道CMV是疱疹病毒性脑炎的病原之一^［3］。本组有12例诊断为CMV脑炎，其中11例临床经过平和，预后良好；另1例死亡，可能与合并有糖尿病、慢性肾衰有关。12例患者中仅1例发病前曾接受过肾移植，其余病例均无肾移植、应用免疫抑制剂治疗或有免疫缺陷的病史。根据我们目前的资料，可以认为CMV导致的疱疹病毒性脑炎是肯定存在的，应引起注意和重视。此外，本组病例4例考虑为EBV脑炎，提示EBV脑炎不仅仅是传染性单核细胞增多症的并发症，也可能是我国疱疹病毒性脑炎的类型之一，同样仍应予以关注和深入研究。

本文的资料表明，应用IFA、PCR、I