关键词： Creutzfeldt；-Jakob病；朊蛋白；免疫组化染色；基因分析

【摘要】目的探讨 Creutzfeldt-Jakob病(CJD)的生前诊断方法，CJD患者基因型有否变异与病理改变和临床表现的关系，以及与免疫组化染色对朊蛋白(prion protein， PrP)在脑内沉积类型之间的关系。方法取CJD患者脑组织，用PrP抗血清为第一抗体的免疫组化染色;并制成15%重量容积比的脑匀浆，注入昆明小鼠脑内，观察1～2年，发病小鼠脑亦经免疫组化染色。取患者静脉血分离白细胞提取DNA,以特异引物扩增PrP片段，常规7种限制性内切酶酶切已知常见CJD易于变异的基因位点，琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果该患者为散发型病例，患者脑内为突触型PrP沉积，传递小鼠脑内亦可见PrP沉积，PrP基因分析表现为密码子129甲硫氨酸纯合子。结论本例无PrP基因变异；脑内突触型PrP沉积的患者，动物传递易于得到阳性结果。对此类患者应早期诊断，防止医源性蔓延。

Clinical and pathological study of Creutzfeldt-Jakob disease with codon 129 Met/Met by animal transmissions and immunohistochemical stain affirmedJiang xinmei, Song Xiaonan, Zhao Jiexu, et al. Department of Neurology, first Teaching Hospital Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021

【Abstract】ObjectiveTo make a clinical and pathological study of Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) diagnosed by Brain biopsy before the patient′s death. MethodsThe brain biopsy samples was stained with hematoxylin-eosin (HE) and the immunohistochemical method, The brain homogenate 15%(W/V) from the CJD patient was inoculated into the mice brains. Gene analysis of the patient with CJD were carried out using the extracted high molecular weight DNA from the peripheral blood lymphocytes of patients. The PrP coding region was amplified by the polymerase chain reaction (PCR) with the primers T-1 and T-2 and checked with seven kinds of restriction enzymes. Results This patient was a sporadic CJD. There were synaptic type PrP accumulating in the patient brain and transmitted to the mice brains. PrP gene analysis expressed codon 129 Met/Met homozygous. Conclusions this patient was a case of sporadic CJD with codon 129 Met/Met affirmed with the animal transmissions and immunohistochemical staining. It would be prejerable to make an early diagnosis of this disease to avoid or minimize the possibility of iatrogenesis.

【Key words】 Creutzfeldt-Jakob disease Prion protein Immunohistochemical stain Gene analysis

Creutzfeldt-Jakob病(CJD)又称皮层-纹状体-脊髓变性、亚急性海绵状脑病。是由异常朊蛋白(prion protein,PrP)在脑内沉积引起的一种以迅速进展的痴呆为主要症状的致死性疾病。CJD是朊蛋白病之一，目前世界上对朊蛋白病的研究已经证实是人畜共患的一种致命的疾病。由于疯牛病的出现，使人们对朊蛋白病的病因研究更加深入。国外最近研究发现朊蛋白病的发生与人体内的PrP基因变异有关。不同密码子的变异决定了朊蛋白病的类型，疾病发生的快慢，病程的长短以及疾病的可传递性。现将1例经动物传递和免疫组化证实的密码子129甲硫氨酸纯合子CJD报道如下。

资料和方法

一、病例报告

男性，73岁，因记忆力下降，言语减少2个月余，近1个月阵发性抽搐于1995年1月12日入院。2个多月前，患者无明显诱因记忆力减退，言语减少，此时四肢活动正常，尚能自理生活。1个多月后上述症状加重，言语不清，左侧肢体活动不灵，1995年12月5日头部CT示脑萎缩，腔隙性脑梗死。按脑血栓治疗10天后出现阵发性抽搐，抽时双眼向左凝视，头歪向左侧，四肢阵挛，尿便失禁。从此不能言语及行走，饮水返呛。1995年1月7日头部MRI双侧底节T₂异常信号，无梗死灶。

既往无手术及输血史，无高血压及糖尿病病史，未去过牧区，家族中无同类患者。

查体：呼之不应，睁眼，双眼发作性向左凝视，伴头颈部向左抽动。压眶刺激双侧鼻唇沟对称，下颌反射阳性，唇反射阳性。四肢肌张力高，腱反射对称亢进，Babinski征阴性，尿便失禁。入院后血常规生化检查未见异常。1995年1月16日取右侧额叶脑活检。

入院期间用神经营养药及其他对症支持疗法，病情不见好转，2周后回当地医院维持治疗。出院时患者呈现无动性缄默状态。跟踪随访患者于1996年3月9日死亡。

二、脑病理检查、动物传递及PrP基因分析方法

1.普通病理检查：活检脑组织常规石蜡包埋，苏木精-伊红染色(HE)、Klüver Barrera染色(KB)及高碘酸-希夫染色(PAS)，光镜观察。

2.免疫组织化学染色：用改进的前处置法，以石蜡切片，加PrP抗血清，用过氧化物酶抗过氧化物酶法(PAP)，苏木精复染后光镜观察^［1］。

3. 该患者活检脑组织制成15%(重量/容积)脑匀浆在无菌条件下注入4周龄昆明鼠脑内，共30只，每只5 μl。观察接种鼠的毛色、体重以及肢体有无运动障碍1年以上，发病鼠处死取脑组织制成石蜡切片，HE及以PrP抗血清为第一抗体的免疫组化染色，光镜观察。

4.取患者静脉血分离白细胞，提取DNA，用引物T₁、T₂进行聚合酶链反应(PCR)，扩增PrP基因的开放可读框架，用AluⅠ消化,酶切密码子102、105位点;NspⅠ酶切129位点;MaeⅠ酶切145位点;TthⅢⅠ酶切178和180位点;BsmAⅠ酶切200位点。SplⅠ酶切位点(CGTACG)在密码子219谷氨酸的等位基因。NlaⅢ密码子232的酶切位点。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。用纯化的PCR产物以ABI 377测定DNA序列并分析结果。

结果

活检脑组织的普通病理染色可见皮层及皮层下神经元大量减少，灰质神经毯海绵状改变，有轻度的胶质增生，脑膜、脑内及血管周围无炎性反应。细胞核内及胞浆内均未见包涵体。免疫组化染色可见大脑皮层突触型PrP沉积。

传递鼠脑样品保存完好的共21只。潜伏期179～854天，平均533天。1年内死亡的鼠脑内海绵状改变不明显，亦无PrP沉积，1年以上死亡鼠17只(81％)，鼠脑内海绵状改变及胶质增生较为明显，这17只中有6只PrP阳性(35％)，其PrP沉积多在局部。PrP基因分析无变异，表现为密码子129甲硫氨酸纯合子(附图)。

M：Φ×174 噬菌体DNAHaeⅢ酶切片段1：甲硫氨酸/甲硫氨酸2：缬氨酸/甲硫氨酸

bp：碱基对

附图NspI酶切密码子129位点

讨论朊蛋白病是人类唯一一种既有传染性又有遗传性的疾病，因此具有3种发病形式，即传染性、散发性和遗传性，包括下述四种类型：(1)CJD又称皮层-纹状体-脊髓变性；（2） Gerstmann-Straussler综合征(GSS)；(3)致死性家族性失眠症(fatal familial insomnia,FFI)；(4)库鲁病(Kuru disease)。Kuru病由食用死亡亲属脑组织而发病，我国没有。FFI较为少见，国内尚无报道，主要表现为严重的睡眠障碍及痴呆。GSS以小脑症状为主，有家族遗传性。人类朊蛋白病最常见的是CJD^［2］。CJD多为散发性，其传染性有报道可通过角膜或硬脑膜移植、外科手术使用了被CJD患者污染的器械和脑电图电极而传播，还可因注射了从人体垂体提取的生长素或使用人促性腺激素而感染CJD^［3～5］。CJD特征如下：

1. CJD临床特点：(1) 早期表现轻度精神或行为异常；(2) 亚急性进行性痴呆和肌阵挛发作；(3) 有视觉障碍,锥体系,锥体外系症状,不同程度的言语障碍和肌萎缩；(4) 晚期常呈无动性缄默或去皮层状态；(5) 少数病人有家族史；(6) 多数病人病程不超过1年。

2.实验室检查特点：(1)脑脊液早期有高浓度的特异性蛋白；(2)动态观察脑电图常在疾病的中期可见周期同步放电（PSD）；(3)晚期CT可见脑萎缩,脑室扩大。

3.组织病理学检查：(1) 大脑皮层海绵状变性；(2)神经元变性脱失；(3)胶质增生；(4)免疫组化染色、脑活检或动物接种阳性^［6］。

本例为老年男性，73岁。以健忘、言语减少为首发症状，经过中有一过性偏瘫，频发抽搐发病3个月即呈去皮层状态，头部MRI示双侧基底节异常信号，无梗死灶，存活16个月。发病3个月时右额叶脑活检HE、KB染色示神经细胞减少，海绵状改变及轻度胶质增生。以PrP抗血清为第一抗体的免疫组化染色呈突触型PrP沉积，传递鼠脑内亦可见PrP沉积。PrP基因分析表现为密码子129甲硫氨酸纯合子。上述特征符合CJD诊断标准，可确定其临床病理诊断为散发型CJD。就本例的诊断过程有几点体会：

1. 对原因不明的痴呆或临床症状不典型的CJD的诊断，头部MRI有重要诊断价值。据文献报道，T₂双侧对称弥漫性的基底节区高信号异常的成