关键词： 帕金森病；腺伴随病毒载体；酪氨酸羟化酶；芳香族氨基酸脱羧酶；基因转移

【摘要】目的：探讨在多巴胺水平对帕金森病进行直接转基因调控。方法应用腺伴随病毒(AAV)载体共转导酪氨酸羟化酶(TH)和芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因于模型大鼠纹状体，以复合感染方式将AAV-TH和AAV-AADC通过立体定向法注射入帕金森病大鼠病损侧纹状体，连续观测转导后大鼠行为改善情况，并以免疫组化方法测定TH和AADC表达。结果TH和AADC基因共转导较单纯TH基因转导更明显改善大鼠行为(P＜0.01)，组织学证据表明两基因在纹状体内获有效而稳定的共表达。结论TH和AADC基因的共转导策略，对提高帕金森病基因治疗疗效有重要意义。

Co-transfer of tyrosine hydroxylase and aromatic amino-acid decarboxylase cDNAs into the denervated striata of Parkinsonian ratsFan Dongsheng^*, Matsuo Ogawa, Imaharu Nakano, et al. *Department of Neurology, The Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100083.

【Abstract】 ObjectiveExplore the possibility of directly transgenic regulation of Parkinson＇s disease at dopamine synthesis level.MethodAAV-TH and AAV-AADC were stereotaxically co-injected into the denervated striatum of Parkinsonian rat; apomorphine-induced rotational behavior and the immunohistochemistry of TH and AADC were analysed. ResultA better behavious recovery was shown in the rats coinjected with AAV-TH/AAV-AADC than those with AAV-TH alone. The immunostaining showed that TH and AADC were co-expressed efficiently in the striatum.ConclusionCo-transfer of TH and AADC cDNAs into the striatum is a valuable strategy to gene therapy for Parkinson＇s disease.

【Key words】Parkinson diseaseAdeno-associated virusVector, tyrosine hydroxylase

Aromatic amino-acid decarboxylase Gene transfer

我们已经报道使用腺伴随病毒(adeno-associated virus, AAV)载体为介导，将多巴胺合成的限速酶酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)基因直接转导帕金森大鼠纹状体的实验结果^［1］。在此，进一步报道以该载体系统将TH基因及多巴胺合成中另一重要催化酶——芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因，共转导该模型大鼠纹状体内的结果。

材料和方法

一、质粒和细胞

pW₁是在AAV基因组反向末端重复序列之间依次含巨细胞病毒早期响应启动子、人类生长激素第一内含子、LacZ报道基因、SV₄₀多聚腺苷信号的载体质粒；pTH或pAADC是分别以源自脑组织的TH或AADC基因将pW₁中LacZ报道基因置换而构建的载体质粒；pIM₄₅是含AAV载体复制和包装所必需基因的辅助质粒，pAd是含提供AAV载体激活条件的腺病毒基因质粒。AAV载体包装细胞为一种人胚肾细胞株：293细胞。

二、AAV载体的制备

以磷酸钙沉积法共转染pW₁(pTH或pAADC)、pIM₄₅及pAd质粒于293细胞，3天后回收，并以冻融法裂解细胞，经离心所获上清即含AAV-LacZ(AAV-TH或AAV-AADC)。以DNA斑点印迹法测定载体滴度，约10¹¹～10¹²颗粒/毫升。

三、帕金森病大鼠模型的制备、转导和行为评定

18只体重200～250 g成年Wistar雄鼠，以立体定向注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)法损毁左中央前脑束，1周后阿朴吗啡行为评定。具体为阿朴吗啡(0.1 mg/kg体重)腹腔注射后15～20分钟间期内，计数大鼠平均每分钟身体旋转360度的次数，若每分钟平均旋转次数大于7次/分钟，即帕金森病大鼠。18只大鼠分5组：对照(未转染293细胞裂解上清)及AAV-LacZ组各3只，AAV-AADC、AAV-TH及AAV-TH/AAV-AADC组各4只。阿朴吗啡评定3周获稳定行为曲线后，分别在左纹状体内立体定向注射对照上清或上述AAV截体，每鼠量约6×10⁸～6×10⁹载体颗粒。转导1周后，继续每周阿朴吗啡评定1次，观察治疗后每分钟平均旋转次数的改变。

四、TH和AADC表达的免疫组化测定

转导6周后，宰杀大鼠并以卵白素生物素复合物(ABC)法行纹状体TH和AADC免疫组化染色。以0.035%四氢氯化二氨基联苯胺将TH表达细胞显示为棕色，以含2.5%硫酸镍铵的0.035%四氢氯化二氨基联苯胺将AADC表达细胞显示为紫色，TH和AADC共表达细胞经双重染色则显示为黑色。

结果

一、TH与AADC基因共转导较单纯TH基因转导更有效改善模型大鼠行为

全部5组大鼠转导1周后，继续每周阿朴吗啡行为评定1次，连续6周。结果发现：对照、AAV-LacZ及AAV-AADC各组大鼠转导前后均无明显行为改变，但AAV-TH和AAV-TH/AAV-AADC两组大鼠转导后，每分钟平均旋转次数明显减少，经与对照AAV-LacZ及AAV-AADC各组大鼠转导后结果进行的重复测定变量分析(repeated-measures ANOVA)，显示存在极显著性差异(P＜0.01)，其中，AAV-TH/AAV-AADC组大鼠较AAV-TH组的每分钟平均旋转次数减少更甚，二者间差异也有极显著性意义(P＜0.01)。

二、TH和AADC基因在病损侧纹状体的共表达

转导6周后，宰杀全部大鼠并以ABC法行纹状体TH和AADC免疫组化染色。结果发现：在AAV-TH/AAV-AADC组大鼠左纹状体，注射部位附近可见TH和AADC阳性细胞。以0.035%四氢氯化二氨基联苯胺将TH阳性细胞显示为棕色，以含2.5%硫酸镍胺的上述物质将AADC阳性细胞显示为紫色，则大多数被转导细胞经双重染色后显示为黑色，表明均兼具TH和AADC活性，为共表达的双重阳性细胞。根据形态学标准如大小、形态、树突类型、胞体位置等，绝大多数阳性细胞可判定为神经细胞。在AAV-TH组大鼠，仅见TH阳性细胞；在AAV-AADC组大鼠，仅见AADC阳性细胞；在对照及AAV-LacZ组则既未见TH也未见AADC阳性细胞。所有脑组织切片均未见任何细胞毒性反应。

讨论

本研究结果显示AAV载体可于在体条件下将两种外来治疗基因——TH和AADC基因，以复合感染方式有效共转导于非分裂的纹状体神经细胞，并使帕金森大鼠行为改善较单纯TH基因转导大大提高(P＜0.01)。

帕金森病是神经系统基因治疗研究的理想病种之一。帕金森病脑内不仅多巴胺神经递质含量明显减少，其合成所需TH和AADC也明显不足^［2］。目前，帕金森病基因治疗的主要策略之一是通过在纹状体内TH基因的表达，使脑内左旋酪氨酸转化为左旋多巴而发挥治疗作用^［3，4］。然而，外源左旋多巴于何处被进一步转化为多巴胺神经递质，是帕金森病迄今尚未解决的基本问题之一。研究发现，纹状体内AADC活性甚微^［5，6］，经口服外源补给的左旋多巴，被认为是在纹状体以外脱羧为多巴胺，而后转移至纹状体内发挥作用^［6］。与左旋多巴口服疗法不同，纹状体内经TH基因表达所催化生成的左旋多巴只能原位转化为多巴胺^［7］，该处内源性AADC活性不足，因此可能大大限制其疗效提高^［6～8］。本研究以AAV载体介导，通过复合感染方式将TH和AADC两种基因共转导纹状体内，其与以往最大不同处是转基因直接调控多巴胺神经递质，而非其前体左旋多巴。这种共转导使纹状体靶细胞中经TH基因表达所催化生成的左旋多巴，随即被共表达的AADC原位转化为多巴胺，从而使帕金森病大鼠行为改善较单纯TH基因转导大大提高，这一新策略对提高帕金森病基因治疗疗效可能有重要意义。

本研究在日本进行，受日本文部省重点领域研究基金、日本科学技术振兴团战略性基础研究基金、上原纪念基金及日中医学交流基金资助

参考文献

1小川松夫，樊东升，小泽敬也，他.Parkinson 病に对する遗子治疗の可能性.现代医疗，1997，29：153-157.

2永津俊治.パキンソン病の基础と临床：病态生化学*分子生物学.治疗，1994，76：1127-1133.

3Jiao S, Gurevich V, Wolff JA. Long-term correction of rat model of Parkinson＇s disease by gene therapy. Nature, 1993, 362:450-453.

4During MJ, Naegele JR, O′Malley KL, et al. Long-term behavioral recovery in Parkinson＇s rats by an HSV vector expressing tyrosine hydroxylase. Science, 1994, 266:1399-1404.

5Jeager CB, Ruggiero DA, Albert VR, et al. Immunocytochemical localization of aromatic amino acid decarboxylase. In: Bjorklund A, Hokfelt T, eds. Handbook of chemical neuroanatomy, vol 2. Amsterdam: Elsevier, 1984. 384-408.

6Kang UJ, Park DH, Wessel T, et al. DOPA-decarboxylation in the striata of rats with unilateral substantia nigra lesion. Neurosci Lett, 1992, 147:53-57.

7Kaplitt MG, Leone P, Samulski RJ, et al. Long-term gene expression and phenoty