关键词： 脑脊髓炎；氧合酶类；一氧化氮

【摘要】目的探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在中枢神经系统脱髓鞘疾病中的作用。方法采用硫辛胺脱氢酶染色和抗诱导型一氧化氮合酶(抗iNOS)抗体的免疫组化方法，对髓鞘碱性蛋白诱导豚鼠产生的实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)病程中，脑和脊髓的一氧化氮合酶(NOS)和iNOS表达情况进行研究。结果在EAE的急性期主要为血管、血管周围细胞、浸润细胞和小胶质细胞显示iNOS免疫反应阳性，在恢复期星形细胞则出现免疫反应阳性。结论提示一氧化氮是EAE早期血脑屏障破坏以及进展期髓鞘和少突胶质细胞破坏的重要介导物质。

Expression of inducible nitric oxide synthase in the central nervous system of guinea pigs with experimental allergic encephalomyelitisYu Guoping^*, Zhu Ke, Yu Tao, et al. *Department of Neurology, General Hospital of PLA, Beijing 100853

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in demyelination of the central nervous system.MethodsThe experimental allergic encephalomyelitis (EAE) was induced in guinea pigs (n=64) and the expression of iNOS in the central nervous system was examined using monoclonal antibody to iNOS by immunohistochemistry and NADPH diaphorase histochemistry in various stages of EAE.ResultsThe results indicated that in the acute stage of EAE, the macrophages invaded the brain, especially in the white matter, and the microglia began to become reactive with the irregular morphological changes. Both of the two kinds of cells expressed iNOS in the early stage of EAE and the expression of iNOS increased obviously at the peak stage of EAE. In the recovery stage, the reactive astrocytes surrounding the lesion also expressed iNOS.ConclusionsThe nitric oxide produced by the glial cells might play a key role in the process of EAE in regard to the destruction of the blood-brain-barrier in the early stage and the myelin and the oligodendroglia in progressing stage.

【Key words】Encephalomyelitis OxygenasesNitric oxide

90年代以来，国外部分学者开始研究一氧化氮(nitric oxide, NO)在中枢神经系统炎性脱髓鞘病中的变化，并认为NO可能在发病过程中发挥一定的作用^［1，2］。我们采用硫辛胺脱氢酶染色(NADPH-d)法和免疫组织化学方法，对实验性过敏性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)豚鼠脑和脊髓中的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)表达的程度、组织细胞类型和不同发病时期的变化进行观察，以探讨NO对中枢神经免疫性疾病的影响，从而为临床治疗提供帮助。

材料和方法

一、材料

雌性Hartley豚鼠64只(二级，购于中国医学科学院动物中心)，6周龄，体重180～230 g。随机分为两部分，每部分32只，分别进行NADPH-d酶组化染色和抗iNOS免疫组化染色。每部分分实验组24只，对照组8只；实验组每只动物于左后足底皮下注射完全福氏佐剂50 μl加牛脊髓碱性髓鞘蛋白(MBP)50 μl(含MBP 100 μg)。实验组又随机分为4组，每组6只，分为发病前3天组、发病初期组、高峰期组和恢复期组；根据MBP诱发豚鼠EAE的平均潜伏期，取脑和脊髓，观察时间分别为免疫后5天(平均发病前3天)、发病后24小时、5天和14天。对照组每只注射完全福氏佐剂50 μl加生理盐水50 μl。取脑和脊髓，观察时间同实验组，每个时间点观察2只。

二、方法

1.EAE脑和脊髓的NADPH-d法酶组化研究：动物采用10%的水合氯醛(350 mg/kg体重)麻醉后，立即暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，快速灌注肝素化生理盐水150 ml，随后灌注4%的冷多聚甲醛(0.1 mol/L PB)约500 ml，灌注完毕后，立即取脑和脊髓置20%蔗糖(0.1 mol/L PB)中保存。

NADPH-d染色方法：标本在Leica切片机上行连续冰冻切片，片厚20 μm，每10张留取1张挂于载玻片上(玻片采用APES处理)；晾干后入0.01 mol/L的PBS(pH值7.4)中浸泡5分钟后，加入孵育液，37℃孵育30分钟。孵育液用0.2% Triton X-100(0.01 mol/L PBS, pH值7.4)加入1 g/L NADPH(Sigma)、0.1 g/L NBT(Sigma)配制。染色完成后入0.01 mol/L PBS洗净，梯度酒精脱水，二甲苯透明，DPX封片观察。空白对照未加NADPH，余步骤同上。

2.EAE脑和脊髓iNOS免疫组化研究：取标本时除灌注4%多聚甲醛(0.1 mol/L PB)800 ml，灌注时间约1小时外，余同NADPH-d染色取标本方法。采用抗鼠iNOS多克隆抗体［NOS2(M19)，SANTA CRUZ］，识别小鼠iNOS的1 126～1 144氨基酸序列，抗体稀释度为1∶100。小胶质细胞识别采用抗蓖麻凝集素RCA-1(VECTOR)，抗体稀释度1∶300；星形胶质细胞的识别采用抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多克隆抗体(DAKO)，抗体稀释度1∶75。

染色方法：全脑及脊髓标本采用冷冻切片机切片，厚度50 μm，每隔250 μm切片1张。采用免疫组化ABC漂染法染色，用Ni-DAB-葡萄糖氧化酶显色系统显色；用1%的明胶贴片，晾干后梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片观察。

结果

发病初期组、高峰期组和恢复期组动物临床均有发病，每组发病3～5只不等，对照组动物未见异常。

一、NADPH-d法酶组化染色

对照组脑和脊髓中部分神经元显示NADPH-d阳性，大部分血管未见NADPH-d染色，少数血管可见个别细胞呈现NADPH-d阳性，推测阳性细胞为血管内皮细胞。而在EAE发病前3天，胸、腰段脊髓白质中的部分血管、血管周围浸润细胞及开始活化的小胶质细胞(与抗RCA-1阳性细胞相似)呈现NADPH-d阳性(图1)，这种NADPH-d阳性的血管分布与发病初期注射辣根过氧化物酶后显示病灶的分布相似，说明临床症状出现前，潜在病灶中血管内皮细胞及血管周围细胞表达NOS增加；在EAE发病初期，除脊髓血管及血管周围细胞NADPH-d染色较前明显增加外(图2)，小脑、脑干和侧脑室周围白质亦出现上述改变；在EAE高峰期，除发病初期的改变外，病灶周围的星形胶质细胞(类似GFAP阳性细胞)出现NADPH-d阳性(图3)，而这种NADPH-d阳性星形胶质细胞在总的活化星形胶质细胞(GFAP阳性)中所占比例很小。在EAE恢复后期，主要为星形胶质细胞呈现NADPH-d阳性，部分血管周围可见大量的星形胶质细胞(图4)。

二、抗iNOS的免疫组化染色

对照组脑和脊髓未见iNOS阳性细胞，血管亦未见染色。发病前3天组抗iNOS免疫组化结果同对照组；EAE发病初期，胸、腰段脊髓病灶中的血管、血管周围浸润细胞以及部分脑膜浸润细胞出现iNOS阳性(图5)，血管周围细胞亦有iNOS阳性小胶质细胞(形态与抗RCA-1阳性细胞相似)出现(图6)；发病高峰期除可见到发病初期的改变外，还可见到血管附近有散在iNOS阳性的星形胶质细胞(形态与抗GFAP阳性细胞相似，图7)。在EAE的恢复期，血管及血管周围细胞表达iNOS的量明显减少(图8)。

讨论

本研究中所采用的多聚甲醛固定组织切片中，不溶于水的甲潜(formazan)可以被具有硫辛氨脱氢酶活性的酶所沉淀，使四唑(tetrazolium)变成蓝黑色，与NOS有关的黄素部分可以催化NADPH-d的活性。除NOS以外的其他几种可以催化NADPH-d活性的酶，由于多聚甲醛的固定而失活。所以，中枢神经系统的NADPH-d酶组织化学染色被认为是NOS活性的标志^［3，4］。

在对照组中枢神经组织NADPH-d染色时，仅有结构型NOS显色，即部分神经元和少量血管内皮细胞，如实验组中其他细胞显示NADPH-d阳性，则为病理状态。

本组NADPH-d酶组织化学染色和抗iNOS抗体免疫组织化学染色结果均显示，在EAE临床症状出现前，病灶中的血管周围细胞、浸润细胞以及小胶质细胞出现iNOS阳性；在发病初期，除上述改变明显外，iNOS阳性的小胶质细胞明显增多，而在高峰期和恢复期，血管周围的星形胶质细胞出现iNOS阳性，这与Okuda等^［2］报道的仅浸润的巨噬细胞呈现iNOS阳性的结果不同。本研究结果显示，EAE病灶中的血管周围细胞(包括浸润细胞)、小胶质细胞以及星形胶质细胞均表达iNOS，只是EAE的不同临床时期所表达iNOS的细胞型不同。以上这些改变可能与EAE的发病机制有关。

1.iNOS产生的机制：EAE病灶中iNOS的产生主要与某些致炎性细胞因子的诱导有关。在离体条件下，脂多糖(LPS)可以诱导NOS的产生，当LPS与干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子共同刺激时，这种诱导作用明显加强^［5，6］。EAE最早期的改变之一就是血脑屏障的通透性异常增加，并伴有免疫细胞在血管周围形成“袖套”样改变以及向组织中浸润，在这过程中，血清中的细胞因子或浸润的炎细胞释放的细胞因子，如IFN-γ、IL-1和TNF-α可以诱导血管周围细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞产生NOS。另外，活化的小胶质细胞在EAE病程中也可产生这些细胞因子。

2.iNOS在EAE中的作用：NO引起EAE的中枢神经系统损害机制目前还不完