关键词： 脊髓性肌萎缩症；PCR-酶切法；基因诊断

摘要目的研究我国近端型脊髓性肌萎缩症(SMA)患者的运动神经元生存基因(SMN)外显子的缺失情况，探讨其快速基因诊断的可行性和临床应用价值。方法应用PCR-酶切法检测26例确诊的SMA患者及20名正常对照SMN基因的第7、8号外显子的缺失情况。结果在26例及25例患者中，分别发现缺失了端粒SMN基因(SMN1)的第7和8号外显子，缺失率达100%(26/26)和96%(25/26)，而正常对照及患者的家系成员均未发现外显子缺失。结论应用PCR-酶切法检测SMN1基因缺失从而进行SMA患者的基因诊断，具有准确、简便和快速的优点。

中图号R744.8

Rapid Gene Diagnosis of Spinal Muscular Atrophy

Wang NingWu ZhiyingMurong ShenxingLin Minting

(Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005)

Objective To study the deletion of survival motor neuron gene (SMN) of proximal spinal muscular atrophy (SMA) in Chinese patients and the feasibility of clinical application of a PCR-enzyme digestion method for the diagnosis of this disease.Methods Using PCR method to detect the deletions of exon 7 and exon 8 of telomere of survival motor neuron gene (SMN1) in 26 SMA patients and 20 healthy controls.Results Compared with 20 normal controls; 26 of 26 SMA patients (100%) and 25 of 26 patients (96%) lacked the SMN1 gene exon 7 and exon 8, respectively. Conclusion Detection of SMN1 gene deletions with the PCR-enzyme digestion method can be served to diagnose SMA patients accurately and quickly.

Key wordsspinal muscular atrophy; PCR-enzyme digestion method; gene diagnosis

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy, SMA)是一种较常见常染色体隐性遗传疾病，由脊髓前角运动神经元变性所致。临床主要表现为进行性、对称性肢体近端肌无力及萎缩。根据起病年龄和临床表现可将本病分为4型。其中18岁前起病者称作儿童型SMA，包括Ⅰ～Ⅲ型。I型SMA即Werdnig-Hoffmann病，为婴儿期最常见的致死性遗传病；Ⅱ型为中间型，常于出生后18个月内起病；Ⅲ型SMA为少儿型(Kugelberg-Welander病)，出生18个月后起病，预后稍好。儿童型SMA的基因定位于5q13.1^［1］，1995年在该区克隆到的运动神经元生存基因(survival motor neuron gene, SMN)被认为是本病的确定基因。国外学者应用单链构象多态分析(single strand conformation polymorphism, SSCP)技术发现，98.6%的患者存在端粒SMN基因(SMN1)缺失^［2］，并应用于临床进行基因诊断。本研究应用PCR-酶切法对我国儿童型SMA患者进行SMN1基因缺失分析，与SSCP方法相比，具有简便、快速及结果清晰等优点，可用于基因诊断。

1材料和方法

1.1研究对象

1.1.1病例组：儿童型SMA患者共26例(男性16例，女性10例)，发病年龄为3～35个月。其中Ⅰ型3例，Ⅱ型13例，Ⅲ型10例。均经肌活检组织化学染色确诊，并符合SMA诊断标准^［3］。

1.1.2对照组：无亲缘关系的正常中国成人20名，无遗传病家族史。

1.2 研究方法

1.2.1DNA抽提：14例患者及正常对照组采用了常规盐析法从外周静脉血白细胞中抽提基因组DNA，12例患者从冻存的肌肉标本中抽提DNA(采用QIAamp Tissue Kit, QIAGEN公司，产品号：29304)。

1.2.2PCR扩增：扩增SMN基因8号外显子引物参照文献［2］。扩增7号外显子引物为SMA7.1：5′-AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA-3′和错配引物SMA7D：5′-CCTTC CTTCTTTTTGATTTTGTTT-3′，由上海生工公司合成。PCR扩增采用50 μL反应体系，包含DNA250 ng, dNTP各200 μmol/L,引物各25 pmol, Taq DNA聚合酶2.5U。采用美国MJ Research公司PTC-150型PCR 仪扩增。扩增条件均为94℃45 s, 56℃45 s,72℃1 min，循环30次，最后于72℃保温5 min。PCR扩增产物长度均为188 bp。

1.2.3PCR产物酶切：取7号外显子的PCR产物15 μL,加入限制性内切酶DraⅠ5U以及相应缓冲液(华美公司产品)，反应总体积为30 μL。8号外显子产物的酶切体系中含扩增片段15 μL、Dde Ⅰ(Promega公司)3.6 U及其酶切缓冲液，加三蒸水至30 μL反应体积。37℃孵育3 h。

1.2.4电泳检测：采用20 g/L普通琼脂糖凝胶，0.5×TBE,5V/cm电压电泳4 h,观察结果。以pGEM-3Zf(+)/HaeⅢ作为分子量标记。

2结果

所有正常对照组，其SMN基因7号外显子的PCR扩增片段，经限制性内酶消化后，均同时出现188 bp和164 bp 2条带；26例患者均缺失代表SMN1的188 bp条带，只看到164 bp的条带。在8号外显子，正常对照均具有188 bp、120 bp和68 bp 3条带；26例患者中，25例缺失SMN1的188 bp片段，仅见有120和68 bp 2条带(附图)。

附图SMN基因第7、8号外显子PCR扩增产物酶切电泳

FigEnzyme digestion analysis of amplified PCR products from exon

7 and 8 of SMN gene

Al-6:exon 7; Al and A2:normal control; A3-A6: SMA patients;

Bl-6:exon 8; Bl and B2: normal control; B3-B6:SMA patients;

Exon 8 of patient B5 is undeletion. M:pGEM-3Zf(+)/HaeⅢ marker

3讨论

虽然各型SMA在临床上可依赖于肌电图及肌肉活检组织化学染色检查进行确诊，但前者在年幼患儿不易配合检查，后者为有创性检查，且需恒冷冰冻切片组化染色的条件，更难以在临床上广泛开展，因此本病极易误诊。1995年，Lefebvre等终于克隆到SMA基因^［2］，并发现大多数患者存在SMN1缺失，这使得检测SMN1缺失进行本病的基因诊断成为可能。

SMN1基因共含有8个外显子，因在染色体的着丝粒侧同时存在着该基因的拷贝(SMN2)，使得单纯采用PCR扩增的方法检测缺失无法进行。由于两者在第7和8号外显子分别存在着单个碱基的差异，因此可应用SSCP技术将它们区分开来。研究显示，90%以上的SMA患者SMN1基因具有第7、8号外显子的缺失，而SMN2未见缺失，据此可用于本病的基因诊断^［4～6］。然而SSCP方法操作较为繁琐，有时条带不易清晰。为此我们参照Van der Steege等的报道^［7］采用PCR-酶切方法进行检测：7号外显子扩增产物经DraⅠ消化后，因SMN1片段上无该酶切点，未能切动；而SMN2片段由于采用错配引物构建了一个DraⅠ位点，188 bp片段经限制性内切酶消化后得到164 bp及24 bp片段。在正常对照中，由于SMN1和SMN2均未缺失，故同时可见到188 bp和164 bp 2条带(24 bp片段较短，已走出胶)。同样，在8号外显子，因SMN2片段存在DdeⅠ位点，酶切后得到120 bp和68 bp片段，SMN1无此切点，故在正常对照组中同时可见188 bp、120 bp和68 bp 3条带。本研究结果表明，本组病例SMN1基因7、8号外显子的缺失率分别达到100%(26/26)和96%(25/26)。说明检测SMN1缺失的方法可用于SMA患者的基因诊断，而且操作简便，结果清晰可靠，易于判断，并可避免肌活检等创伤性检查。这对SMA家系的遗传咨询及产前诊断亦有重要价值。

△国家自然科学基金(39600051)和福 建省教委基金(K95029)资助

参考文献

1Melki, J, Burlet P, Clermont O, et al. Refined linkage map of chromosome 5 in the region of the spinal muscular atrophy gene. Genomics, 1993, 15:521-524

2Lefebvre S, Nurglen L, Rebouillets, et al. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining. Cell, 1995, 80:155-165

3Munsat TL, Davies KE. International SMA consortium meeting (26-28. June 1992, Boon, Germany). Neuromuscul Disord, 1992, 2:423-428

4Rodrigues NR, Owen N, Talbot K, et al. Deletions in the survival motor neuron gene on 5q13 in autosomal recessive spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet, 1995, 4:631-634

5Bussaglia E, Clermont O, Tizzano E, et al. A frame-shift deletion in the survival motor neuron gene in Spanish spinal muscular atrophy patients. Nat Genet, 1995, 11:335-337

6Chang J-G, Jong Y-J, Huang J-M, et al. Molecular basis of spinal muscular atrophy in Chinses. Am J Hum Genet, 1995, 57:1503-1505