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1材料与方法取新生Wistar大鼠大脑皮层组织，经8～14天原代神经元培养后，随机分为正常对照组(18个细胞)，创伤组(创伤2.25 h、2.5 h、3 h、6 h、12 h及24 h组，每组细胞数为16)，治疗组(神经元分别于液压冲击伤后0.25 h、0.5 h、1 h、4 h、10 h及22 h进行持续2 h的亚低温(32±0.5)℃治疗，每组细胞数为16)。［Ca2+］i的测定：培养的神经元，于37℃条件下用Fluo-3／AM(终浓度10μmol/L)负载45 min。用Insight-PlusIQ型激光共聚焦显微镜488 nm氩激光激发而产生荧光，测定其荧光强度。［Ca2＋］i标定公式：［Ca2+］i=Kd［(F-Fmin)/(Fmax-F)］，式中Kd为400 nmol/L，F为测量的相对荧光值，Fmax为加入10μmol/L 4-Br-A23187的高钙液(10 mmol/L K2CaEGTA,10 mmol/L K-mops,100 mmol/L KCl)后所得最大荧光值，Fmin为加入10μmol/L 4-Br-A 23187的无钙液(10 mmol/LK2H2EGTA，10mmol/L K-mops,100 mmol/L KCl)后所得最小荧光值。［H＋］i的测定：培养的神经元细胞，于37℃条件下用BCECF/AM(终浓度0.25 μmol/L)负载12 min。用Insight-plusIQ激光共聚焦显微镜488 nm氩离子激光激发，记录530 nm/640 nm发射荧光，求二者之比，根据标准曲线求出细胞内pH值。
2结果脑创伤后神经元细胞内［Ca2+］i和［H＋］i逐渐升高，分别于伤后24 h［(2664.17±155.09)nmol/L］和12 h(pH值6.016±0.196)达高峰，48 h仍维持较高水平。亚低温可降低创伤后神经元细胞内［Ca2+］i及［H＋］i的升高幅度，伤后30 min以内应用亚低温可明显降低神经元细胞内［Ca2+］i及［H＋］i，伤后15 min使用亚低温，细胞内［Ca2+］i和pH分别为［(96.04±25.98)nmol/L和（6.662±0.063),P＜0.01］；伤后30 min使用亚低温，细胞内［Ca2+］i和pH分别为［(238.24±29.91)nmol/L］和(6.684±0.069)，P＜0.01。而创伤1 h以上应用则无效(P＞0.05)。
3结论本实验结果表明亚低温对脑创伤后神经元细胞内神经生化反应可能仅仅起抑制作用(如：减少兴奋氨基酸的释放；减少ATP消耗；减轻蛋白激酶C活性的升高等)，并不是阻断作用。因此，随着伤后时间的延长，各种导致Ca2+超载及酸中毒的途径逐渐开放，最终导致伤后1小时以上应用亚低温无效。可见亚低温具有延长治疗时间窗的作用。
(2000-03-15收稿)
