以往认为，脑缺血后迟发性神经元死亡(delayed neuronal death, DND)主要是一种被动的坏死过程，近年来的资料表明主动的细胞凋亡与DND紧密相关^［1］。但目前对脑缺血后细胞凋亡的分子机制尚不清楚。全脑缺血后DND与p53、p21基因是否有关以及这两者之间是否有关，国内外少见报道。本文对此作一探讨。

1资料

1.1实验动物模型及分组：成年Wistar大鼠，雌雄各半。参照Pulsinelli法制作全脑缺血15 min再灌流模型^［2］。假手术(sham)组不夹闭颈总动脉，余步骤相同。实验动物分全脑缺血15 min再灌流6 h、12 h、 24 h、48 h、72 h、96 h组，每组6只，sham组包括24 h和48 h组，每组3只。

1.2HE染色观察海马组织病理学改变：大鼠脑部石蜡切片(4 μm)，HE染色后，光镜观察海马组织病理学变化，显微测微尺测量CA1、CA3区锥体细胞的密度(锥体细胞数/mm)。

1.3LSAB法检测海马p53、p21蛋白的表达：采用抗原修复的过氧化物酶标记的链霉卵白素生物素(LSAB)法，以多克隆p53抗体或单克隆p21抗体分别检测相邻大鼠脑组织石蜡切片中p53、p21蛋白的表达。阴性对照用PBS代替一抗；阳性对照采用临床阳性组织切片。

1.4原位分子杂交法检测p53 mRNA的表达：制作脑冠状冰冻切片(厚15 μm)，以地高辛标记的p53 RNA探针，采用原位分子杂交漂浮法，检测脑组织切片中p53 mRNA的表达。阴性对照组不加p53 RNA探针。

1.5显色定量及统计学处理：切片中显色阳性的神经元定量采用显微镜计数法，以阳性反应的锥体细胞数/视野表示。细胞核外的阳性显色采用Leica-Q 500 MC图像分析系统定量，计算其阳性单位^［3］。计量数据以平均数±标准差表示，进行F检验或秩和检验，P＜0.05为显著性界限。

1.6结果：sham组中，可见海马有3～4层锥体细胞，排列整齐紧密。高倍镜下见这些神经元核大而圆，透明，有1～2个明显的核仁。全脑缺血再灌流后6 h或12 h，海马CA1区结构正常；24 h时，少数锥体细胞体积缩小，核不规则，深染；48 h时，CA1区失去正常结构，大量变性，核固缩深染，胞浆嗜伊红。72 h(49.25±7.95)或96 h时，CA1区锥体细胞明显减少，损伤严重。CA3区损伤较轻，于再灌流后72 h，锥体细胞密度才明显降低(151.92±11.48)，但降低程度仍明显小于CA1区。

阴性对照组、sham组未检测到p53、p21蛋白的表达，阳性对照组p53、p21蛋白表达阳性。缺血组相邻切片的p53、p21蛋白表达的时间、区域分布及阳性程度接近，范围波及海马结构、大脑皮层、丘脑、下丘脑等区域。海马周白质区，如海马槽、背侧穹隆的p53、p21蛋白表达于再灌流后6 h出现，呈纤维束状分布，72 h达高峰。全脑缺血再灌流24 h，CA1区锥体细胞核出现p53、p21蛋白的微弱表达，随后逐渐增加，72 h达高峰(59.56±2.06，60.06±3.11)后下降。CA3区锥体细胞核于再灌流后48 h才出现p53、p21蛋白的表达，72 h达高峰(33.05±2.75，34.06±3.51)，但表达强度较CA1区弱。

阴性对照组、sham组海马以及各组的其它区域未检测到p53 mRNA的表达。缺血组于再灌流后6 h在CA1、CA3区检测到p53 mRNA的表达，并逐渐增多，于再灌流48 h时达高峰(11.95±1.71，7.40±0.31)后下降，96 h时仍存在。高倍镜下可见p53 mRNA于锥体细胞胞浆内表达，呈蓝色环状，中间包绕着细胞核。同CA3区相比，CA1区p53 mRNA表达明显增多，密度较大。

2讨论

我们发现：①全脑缺血再灌流引起海马CA1区p53、p21蛋白及p53 mRNA表达增加，相邻切片p53、p21蛋白表达的时间、区域分布以及阳性程度都极其接近。②对缺血损伤敏感、DND严重的区域，如CA1区，p53、p21蛋白表达强于对缺血损伤敏感性差、DND轻的区域，如CA3区，说明p53、p21蛋白表达程度与DND的轻重呈正比。③白质区的神经纤维较灰质区的神经元细胞核先表达，这一发现，我们^［4］和Mcgahan等^［5］分别报道过，其功能如何，尚待进一步研究。就这一现象，推测有两种可能，或者神经纤维本身直接合成这两种蛋白^［6］，或者锥体神经元胞体先合成p53、p21蛋白，然后迅速通过神经纤维运输出去。④海马CA1区DND主要发生在脑缺血再灌流48 h后，这一时间延搁或许与p53、p21蛋白的合成并达到一定量，从而发挥作用所需要的时间有关。

我们尚不能辨别检测到的p53蛋白是野生型(wt-p53)，还是突变型(mt-p53)，由于p21与p53蛋白表达情况相近，且mt-p53对细胞增殖起促进作用，推测脑缺血导致海马表达的是wt-p53，后者再激活p21基因表达p21蛋白，导致细胞凋亡。由于神经元是不可再生细胞，一般处于G₀期，不进入细胞周期，有人认为p53基因介导的非再生型细胞，其最终结果是死亡而不是修复^［7］。

总之，全脑缺血再灌流后海马p53、p21蛋白及p53 mRN表达增加，并且它们的表达在CA1、CA3区之间存在着差异，提示其与全脑缺血后海马DND之间存在一定的关系，并可能对DND起促进作用。

本课题为1995年国家自然科学基金(批准号：39570263)和广东省自然科学基金(批准号：950537)资助项目

参考文献

1，刘红梅，高天明，佟振清. 大鼠全脑缺血再灌流后CA1区锥体细胞延迟性凋亡的实验研究. 中国神经精神疾病杂志， 1998， 24(增刊)：7

2，Pulsinelli WA, Brierley JB. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke, 1979, 10(3):267

3，申洪. 免疫组织化学染色的定量方法研究(Ⅲ). 中国组织化学与细胞化学，1995， 4(1)：89

4，Tong ZQ, Liu HM, Zhang JD, et al. Expression of p53, p21 proteins and dealayed neuronal death in brain of rats following transient global ischemia. Eur J Neurosci, 1998, 10(suppl):95

5，Mcgahan L, Hakim AM, Robertson GS. Hippocampal myc and p53 expression following transient global ischemia. Brain Res Mol Brain Res, 1998, 56(1):133

6，Miyashiro K, Dichter M, Eberwine J. On the nature and distribution of mRNAs in the hippocampal neurites:implications for neuronal functioning. Proc Natl Acad Sci, 1994, 91(23):10800

7，Levine A. The role of p53 as a tumor suppressor in human cancers. Adv Oncol, 1992, 8(1):3

(1999-07-15收稿)