关键词： 聚合酶链反应-单链构像多态性分析；Ⅰ型神经纤维瘤病；基因

【摘要】目的探讨国人Ⅰ型神经纤维瘤病(NF1)基因突变的热点。方法用PCR-SSCP方法检查NF1基因28和31号外显子共约1060 bp，约占NF1基因全部编码区的6.95%。结果在27个家系中，发现4个家系(14.82%)、13例病人(23.64%)存在NF1基因突变。结论提示本组病例28和31号外显子可能为突变热点。对突变性质的定论有赖于DNA序列分析。

Mutational detection on exon 28 and 31 of NF1 gene

Zhou LieminLiu ZhuolinLiang XiulingZhou Jueqian

（Department of Neurology, The First Affiliated Hospital, Sun Yet-sun University of Medical Scienses. 58, Zhongshan Road Ⅱ, Guangzhou. 510080. Tel:020-87332200-8283）

【Abstract】Objective To explore the mutation hot spot of NF1 gene in Chinese.MethodsBy PCR-SSCP analysis, we examined 627 bp of exon 28 and 31 of NF1 gene in Chinese patients with NF1, which accounted for 6.95% of NF1 total coding region.ResultsWe found that mutations of NF1 gene occurred in 13 patients (23.64%) from 4 families (14.82%) of 27 studied families.ConclusionsThe result suggests that eson 28 and 31 may be one of the mutation hot spot of NF1 gene in our cases. The detection of the mutagenesis nature must rely on the DNA sequence analysis.

【Key words】PCR-SSCP analysisNeurofibromatosis type 1Gene

Ⅰ型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 1, NF1)为源于神经嵴细胞分化异常而导致的多系统损害的常染色体显性遗传病。国外患病率为1/3000～3500；国内广东省为4/10 000。其主要临床表现有皮肤多发牛奶咖啡斑和雀斑，全身多发神经纤维瘤，虹膜错构瘤以及视神经胶质瘤、骨发育异常和智能低下。约15%～19.87%合并中枢神经系统肿瘤。NF1基因是由59个外显子编码的约11 kb的转录本，分布于17 q^11.2约350 kb的基因组DNA上。NF1基因新突变率高达到1/10 000，约是大多数单基因病的100倍^［1］。本文应用PCR-SSCP方法检测了28及31号外显子，探讨NF1基因的突变热点及其机制。

1资料和方法

1.1研究对象研究组：27个NF1家系，包括27例先证者及其74名一级亲属，共有NF1病人55例，均符合NIH 1987年制定的NF1诊断标准^［2］。对照组：30名神经科门诊和/或病房住院的非NF1病人，其中急性脑血管病15人，血管性头痛5人，帕金森病5人，椎间盘突出症5人。男女各15人，年龄26～82岁，平均(52.4±2.7)岁。

1.2方法常规酚-氯仿抽提法提取人血白细胞基因组DNA。参照文献^［1，3］设计并合成两对引物，分别扩增NF1基因28和31号外显子(原易位断点区1和4号外显子)及其侧翼部分内含子。片段大小分别为637 bp和423 bp。

引物序列如下：exon28: ①5-AATGAATCCAGACTTTGAAGAA

TTG-3；②5-GCCAGGATATAGTCTAGTTAGTC-3。exon31:①

5-ATAATTGTTGATGTGATTTTCATTG-3；②5-AATTTTGAACC

AGATGAAGAG-3。以上引物在中国科学院上海细胞生物学研究所合成。

PCR扩增：30 μL反应体积放入PE公司的PCR 9600仪扩增。预变性98℃ 6 min→85～90℃加Taq多聚酶0.5 μL(1.5 U)→61℃ 30 s→72℃ 40 s；然后按94℃ 40 s，61℃ 30 s， 72℃ 40 s共运行33个循环；末循环为94℃ 40 s，61℃30 s， 72℃ 10 min。取4μL PCR扩增液加1.5 μL上样缓冲液，并以1 kb Marker或Ladder DNA EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ为分子量标记，行2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的产率及特异性。

二重引物PCR扩增：对家系F行二重引物PCR扩增。总反应体积50 μL(模板DNA 0.25 μg)，预变性98℃ 6 min→85～90℃加Taq多聚酶1 μL(3 U)，然后按94℃ 40 s，61℃ 30 s,72℃1 min共运行23个循环；最后72℃ 10 min延伸。取10 μL PCR扩增液加2.5 μL上样缓冲液，并以123 bp DNA为分子量标记，行2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

SSCP-PAGE：按分子克隆实验指南^［4］配6%聚丙烯酰胺凝胶，样品预处理：Marker0.5 μg加18 μL甲酰胺染料，全部上样：PCR产物8 μL(约1 μg)加18 μL甲酰胺染料，95℃ 变性5 min，即碎冰速冷10 min。电泳条件：环境温度4℃，缓冲液1×TBE，恒压8 V/cm，电流20～4 mA，时间为31号外显子32 h；28号外显子48 h。电泳完毕银染^［5］。

2结果

2.1PCR扩增除FI-2外，27例NF1先证者及其亲属和正常对照均分别获得覆盖28号外显子和31号外显子及其侧翼部分内含子的637 bp和423 bp的特异性扩增带。而FI-2仅见1条423 bp特异性扩增带，改用两对引物多重PCR检测FI-2及其亲属，证实FI-2缺失了28号外显子及部分内含子(图1)。

Fig.1The results of PCR amplification of exon 28 and 31 of NF1 gene from family F are analyzed. Lane M contains the 123 bp fragment. The deletion of exon 28 and near intron of NF1 gene occur in patient FI-2

1家系F NF1基因28、31号外显子二对引物PCR扩增结果：M为123 bp的DNA片段标准，FI-2缺失28号外显子及部分内含子

2.2PCR-SSCP分析PCR-SSCP分析可见两种等位基因型。一种为纯合子，表现为两条序列互补的DNA单链。此等位基因见于正常对照和大部分NF1患者。但对NF1家系D和K的28号外显子PCR-SSCP分析发现：先证者和患病亲属出现DNA泳动变位，使得两条互补DNA单链电泳迁移率比正常对照和家系中非NF1者要快(见图2)，并随NF1遗传。另一种等位基因型为杂合子，这在对NF1家系P的31号外显子PCR-SSCP分析，结合双波长薄层扫描仪检测后被证实。结果显示：正常对照(C)和NF1家系P中非NF1成员(PI-2、PII-3)为纯合子，表现为两条序列互补的DNA单链。两条带高峰接近，峰面积比值接近1∶1。而NF1先证者及其子女和外孙(PI-1、PII-1、PIII-2、PII-4、PIII-1～PIII～4)在PCR-SSCP上呈现杂合子，即在两条正常互补的DNA单链之间，可见一异常单链电泳带，此为新等位基因，第一带(c)峰面积比值接近二(e)、三(d)带之和。这一异常单链电泳带系因DNA单链构象改变而导致泳动变位，其互补链虽有碱基序列改变，但构象无改变，故与正常等位基因单链电泳迁移率一致。这一新等位基因与NF1一并遗传(见图3)。

3讨论

NF1基因是目前所有单基因病中突变率较高的一种。综合已发表的126例NF1的45种突变，虽未发现明显的突变热区^［6］，但多数突变发生在28～36号外显子区，而非NF1-GRD^［7～9］。早期研究发现28～36号外显子区包含了Ledbetter和Schmidt等报道的两例易位断点^［3，10］。随后的研究发现28和31外显子突变发生率较高，前者的突变常导致较重的临床表型^［12］，而后者见于不同文化背景、不同人种以及家族性或散发性NF1患者^{［3，12，13］}。故本实验选择28号和31号外显子，用PCR-SSCP方法对中国人NF1基因突变进行初步研究。

Fig.2The results of PCR-SSCP of exon 28 of NF1 gene from family D are analyzed. Lane C, the normal control and lane DI-2, the mother of proband with NF1 contain both a and b single strand. Lane DII-1 and DI-1, the patients with NF1 contain the abnormal mobility shift of a and b

2家系D NF1基因28号外显子PCR-SSCP分析结果：C为正常对照，DI-2为先证者母亲，可见a、b两条单链电泳带；DII-1、DI-1为NF1患者，其两条单链电泳带a和b发生泳动变位

Fig.3The results of PCR-SSCP of exon 31 of NF1 gene from family P are analyzed. Lane C, the normal control, PI-2 and PII-3, the normal relatives of the patient with NF1 show homozygote. Lane PI-1, PII-1, PII-2，PIII-1 and PIII-4, who are the patients with NF1, show heterozygote

3家系P NF1基因31号外显子PCR-SSCP分析结果：C为正常对照，PI-1、PII-1、PII-2、PIII-1～PIII-4系NF1患者，为杂合子；PI-2、PII-3为纯合子

本研究根据文献提供的NF1基因突变多发区信息，用PCR-SSCP分析法检查了27例NF1先证者及其74名亲属(其中28例为NF1患者)28号和31号外显子及其侧翼部分内含子DNA序列，共约1060 bp。

通过PCR-SSCP分析，