关键词： 神经鞘瘤；微卫星标记；杂合子丢失

【摘要】目的分析神经鞘瘤22号染色体(CHR22)杂合子丢失及其与临床行为之间的关系。方法选择4个具有高度多态性的微卫星标记物，通过变性聚丙烯酰胺凝胶、银染观察36例神经鞘瘤CHR22杂合子丢失(LOH)频率；以免疫组织化学方法检测Ki-67、PCNA的增殖指数。结果36例神经鞘瘤中15例发生CHR22 杂合子丢失(41.6%)，4个微卫星标记物缺失的频率分别为19.4%(D22S268)、22.2%(D22S264)、19.4%(D22S280)、 16.7%(CRYB2);发生CHR22缺失的神经鞘瘤的增殖指数高于无缺失者(P＜0.05)。结论CHR22 杂合子丢失是神经鞘瘤发生中的常发事件，缺失的区域包括NF2基因，CHR22 杂合子丢失与听神经瘤的临床行为有一定的关系，CHR22 杂合子丢失可能是神经鞘瘤增殖的重要因素。

Loss of heterozygosity for markers on 22 chromosome in sporadic schwannoma

Bian LiuguanShen JiankangLuo Qizhong

（Department of Neurosurgery, Ren Ji Hospital, Shanghai Second Medical University. 145 ShanDong Road, Shanghai. 200001. Tel: 63260930-2116）

【Abstract】Objective To analyze the loss of heterozygoisty for markers on 22 chromosome and its relationship with clinical features.Methods To investigate the frequency of CHR22 LOH in 36 schwannomas, we selected four highly polymorphic microsatellite DNA markers (D22S264,D22S268,D22S280,CRYB2) by denatured polyacrylamide gels and silver staining. The proliferative index of schwannoma was calculated by Ki-67, PCNA immunohistochemistry.ResultsFifteen of 36 patients with sporadic schwannomas (41.6%) showed allele loss. The frequency of these markers were 19.4% for D22S268, 22.2% for D22S264, 19.4% for D22S280 and 16.7% for CRYB 2. The proliferative index of schwannomas with LOH were significantly higher than those without LOH (P＜0.05). In acoustic neuromas, patients with LOH were younger at the age of diagnosis, and larger tumor size, had shorter history and higher growth rate.ConclusionsCHR22 LOH was a frequent event in the tumorigenesis of sporadic schwannoma. The presence of CHR22 LOH was related to clinical features.

【Key words】Schwannoma Microsattelite markers Loss of heterozygosity▲

神经鞘瘤可以散发，亦是Ⅱ型多发神经纤维瘤病(neurofibromatosis 2, NF2)中的常见肿瘤^［1］，有证据表明NF2基因为神经鞘瘤的肿瘤抑制基因^［2，3］，NF2基因的体系突变可引起其附近多态性DNA标记物中发生杂合子丢失(loss of heterozygosity, LOH),通过分析LOH的区域，可阐明神经鞘瘤发生的分子机制，然而这些分子异常与神经鞘瘤行为之间的关系尚不清楚。本研究选择4个具有高度多态性的微卫星标记物，分析神经鞘瘤22号染色体(CHR22)上可能存在的缺失，探讨神经鞘瘤的分子遗传学改变与听神经瘤临床行为之间的关系。

1资料与方法

1.1临床资料收集1996年9月至1999年3月间神经鞘瘤36例，其中听神经瘤16例，脊神经鞘瘤18例，三叉神经鞘瘤1例，眶内神经鞘瘤1例。

1.1.1听神经瘤：男7例，女9例，左侧7例，右侧9例，年龄22～72岁，平均(47±13)岁，肿瘤直径＜2 cm 4例，2～3.9 cm 7例，4～6 cm 3例，＞6 cm 2例，首发症状表现为耳

鸣和听力下降12例，三叉神经、面神经受累4例，后组颅神经受累2例，出现小脑征3例；16例肿瘤中复发肿瘤3例，肿瘤发生囊变的有2例。

1.1.2其它神经鞘瘤：男8例，女12例，年龄20～77岁，平均(48±14)岁，其中复发肿瘤3例，男性2例，女性1例，首发症状表现为根痛的有13例，运动障碍4例，触痛觉减退7例。脊神经鞘瘤中，肿瘤位于颈部的有7例，胸部4例，腰部4例，骶管3例，大部分肿瘤位于硬膜下(14例)，硬膜外2例，呈哑铃状2例。1例三叉神经鞘瘤首发症状为头痛，无阳性体征，眶内神经鞘瘤1例主要表现为眼球突出。

1.2方法

1.2.1标本收集：常规酚-氯仿抽提、乙醇沉淀法提取病人血和肿瘤组织中的基因组DNA。

1.2.2微卫星标记：选择具有高度多态性的4个微卫星标记物D22S264^［4］、D22S268^［5］、D22S280^［6］、CRYB2^［4，7］，它们在CHR22q上的顺序：cen-D22S264-CRYB2-D22S268-D22S280-tel，其中D22S264、CRYB2位于NF2基因的着丝端(centromere),D22S268、D22S280位于NF2基因的端粒端(telomere)，它们的杂合性、CHR22q上的位置、引物序列和PCR条件详见相关文献^［4～7］。

PCR反应：按文献的PCR反应条件进行^［4～7］。PCR产物在垂直电泳仪上进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

按Budowle法^［8］略修改进行硝酸银染色，固定液改为：无水乙醇100 mL，冰醋酸5 mL，定容1 000 mL；显色液改为：0.375 mol/L NaOH,每1 000 mL中加10.8 mL甲醛。

1.2.3Ki-67、PCNA免疫组织化学染色：36例神经鞘瘤标本制成4 μm厚的石蜡切片，常规脱蜡，酒精梯度脱水，抗原修复→95%正常山羊血清封闭→加入一抗(PCNA 1∶100稀释、Ki-67 1∶50稀释)，37℃孵育30 min→加生物素标记的二抗1∶100稀释，37℃孵育10 min→辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素1∶100稀释，37℃孵育10 min→DAB显色剂显色，HE复染，封片。

1.3检测指标

1.3.1生长速率：所有病例均行MR检查，根据MR图像分别测量内、外径和前后径，以最大者为直径。生长速率计算公式：GR=直径/病程(cm/y)。

1.3.2增殖指数：PCNA、Ki-67的阳性细胞为细胞核全部或部分呈棕黄色；PCNA、Ki-67增殖指数(LI)：按10个高倍视野(约1?000个细胞)出现PCNA、Ki-67阳性细胞数计算，用百分率表示。内皮细胞、出血区域以及切片边缘的阳性细胞除外。

1.4统计学分析t检验分析杂合子丢失频率与病程、肿瘤大小、年龄之间的相互关系。

2结果

研究发现36例神经鞘瘤中有15例发生LOH(图1，2)，占41.6%，其中听神经瘤7例(7/16)，其它神经鞘瘤8例(8/20)。7例D22S268缺失(19.4%)，8例D22S264缺失(22.2%)，7例D22S280缺失(19.4%)，CRYB2缺失6例(16.7%)。发生杂合子缺失肿瘤(Ki-67：7.71%±5.58%;PCNA:4.37%±4.57%)的增殖指数显著高于无缺失者(Ki-67：4.70%±3.56%;PCNA:1.87%±2.34%)，P＜0.05。

2.1听神经瘤同时发生4个微卫星标记物缺失的有2例(2/16)，其中1例生长速率大(10.63 cm/y)，2例均有颅神经受累症状；D22S268缺失有5例(5/16)，D22S264缺失有4例(4/16)，D22S280、CRYB 2缺失者各3例(3/16)。颅神经受累的4例中有3例发生LOH，复发的3例中有2例发生LOH；发生LOH的平均年龄(43±13)岁，低于无LOH者［(46±9)岁］。LOH患者的肿瘤生长速率高于无LOH者，同样LOH者病程较短、肿瘤较大，发生缺失肿瘤的增殖指数(Ki-67、PCNA)比无缺失者高，但它们之间均无统计学意义，见表1；两种增殖指数与生长速率之间有显著的相关性，r分别为0.8772(Ki-67)和0.877?4(PCNA)，P＜0.001。

2.2其它神经鞘瘤无1例同时发生4个标记物的缺失，D22S280、D22S264缺失的均为4例(4/20)，CRYB2缺失各3例(3/20)，D22S268缺失2例(2/20)；2例同时发生了D22S264和D22S280缺失(均为复发)，另1例复发肿瘤同时发生D22S264和CRYB2缺失；1例眶内神经鞘瘤同时发生D22S280和CRYB2缺失；颈部7例肿瘤中的3例、胸腰骶部各1例发生LOH，14例硬膜下肿瘤有4例发生LOH，2例哑铃状肿瘤发生LOH；发生LOH患者的年龄与无缺失者相仿；缺失者的增殖指数(Ki-67：7.71%±5.51%;PCNA:4.24%±4.56%)高于无缺失者(Ki-67:4.12%±3.49%;PCNA:1.48%±1.70%)，但无统计学差异。

3讨论

本组资料中发生CHR22 LOH的有15例(41.6%)，其发生率与文献报道相似(33%～59%)^［7，9］，本研究所用引物2个位于NF2的着丝端(D22S264、CRYB2)，2个位于NF2基因的端粒端(D22S268、D22S280)，其中D22S268离NF2的距离最近。5/16的听神经瘤发生D22S268缺失，高于其它3个标记物，而这种缺失在其它神经鞘瘤仅占2/20，此提示D22S268为听神经瘤提供更高的信息量。

本结果提示CHR22等位基因丢失是散发神经鞘瘤的常发事件，发生LOH的区域包括NF2基因，CHR22缺失的频率与神经鞘瘤的细胞增殖有一定的关系，即缺失的肿瘤细胞比无缺失的肿瘤细胞更易增殖，但在听神经瘤或非听神经瘤的神经鞘瘤中却没有统计学意义。在听神经瘤中同样发现：发生缺失的患者年龄较轻，肿瘤较大，肿瘤生长较快，亦无统计学意义，可能与样本量小有关。本组资料中6