【摘要】目的探讨早老素-1基因突变在散发性阿尔茨海默病(Sporadic Alzheimer′s disease,SAD)患者发病机制中的作用。方法应用聚合酶链反应-单链构像多态性(PCR-SSCP)及DNA直接测序技术检测68名SAD患者、13名血管性痴呆(VD)患者和65名正常老年人的早老素-1基因第5号外显子。结果发现4名SAD患者的PCR产物SSCP分析发生泳动异常，DNA序列分析发现：这4名SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG错义突变(388位点发生C→A突变)，使编码的氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu 130 Met)；157号密码子发生了GTG→CTG错义突变(469位点发生G→C突变)，使编码的氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸(Val 157 Leu),另有11名患者SSCP表现为一条单链增快，其性质待定。结论SAD患者也存在早老素-1基因第5号外显子突变，该突变点可能为中国人SAD患者早老素基因突变点之一。

A study on new mutation of exon 5 of presenllin-1 in Alzheimer's disease. Ma Qiulan, Qian Caiyum, Liu Zhuolin, Lu Xilin, Lin Hongchuan. Department of Neurology, First Affiliated Hospital, Sun Yat-sam University of Medical Sciense. 58 Zhongshan Ⅱ Road, Guangzhou. 510080. Tel:87755766-8292

【Abstracts】Objective To explore the role of the mutation of presenilin-1 in pathogenesis of sporadic Alzhemier's disease. MethodsExon 5 of presenilin-1 was analysed by using polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) and ABI 310 genetic analyzer technique in 68 patients with Alzheimer's disease, 13 patients with vascular dementia and 65 normal controls. ResultsMobiligy shifts of SSCP in exon 5 of presenilin-1 was detected in 4 cases with Alzheimer's disease. Two missense mutation were found in the patients by DNA sequence analyse, one mutation was Leu 130 Met and the other was Vall 57 Leu.Another 11 patients showed one single strend shifted rapidly. But none mobility shifts of SSCP were found in patients with vascular dementia and normal controls. Conclusions It is shown that mutations in exon 5 of presenilin-1 also exist in the patients with sporadic Alzhemers disease, it might be one of the point mutation in sporadic Alzhemer's disease of Chinese people.

【Key words】Alzheimer's disease Presenilin-1MutationGenetics

近几年研究资料表明，家族性阿尔茨海默病(familial Alzheimer's disease, FAD)主要与遗传因素有关^［1］，属常染色体显性遗传，目前已确定与AD有关的基因有4个，分别位于21、19、14和1号染色体上。编码淀粉样前体蛋白(APP)的基因位于21号染色体，但APP基因突变只能解释少数FAD患者。位于19号染色体上的apoE4基因被认为是AD发病的敏感基因(suceptibility gene)，与晚发性FAD和散发性AD均有关，但缺乏特异性和敏感性。最近研究发现，多数早发性FAD与14号染色体上的早老素-1(Presenilin-1,PS-1)基因突变有关^［2］，少数早发性FAD与PS-2基因突变有关。早老素基因与散发性阿尔茨海默病(Sporadic Alzheimer's disease,SAD)的关系如何?目前国内外研究较少，为探讨PS基因突变在SAD发病机制中的作用，我们用聚合酶链反应-单链构像多态性(PCR-SSCP)和DNA直接测序技术检测了68名SAD患者、13名血管性痴呆(VD)患者及65名正常老年人(NC)PS-1基因5号外显子(exon 5)，发现在SAD患者中也存在PS-1基因5号外显子突变。

1资料与方法

1.1研究对象AD组68例，男22例，女46例，平均年龄(79.6±8.1)。全部病例从广州市老人院中筛选，应用MMSE、HDS-R、ADL量表进行痴呆筛选调查，采用ADRDA-NINCDS临床诊断标准，把诊断为“可能性AD”，的患者列为研究对象，全部病人无血缘关系。MMSE痴呆判断标准为：文盲组＜17分，小学组＜20分，中学以上组＜24分。HIS缺血指数＜4分。VD组13例，男4例，女9例，平均年龄(77.0±7.5)岁。应用MMSE、HDS-R、ADL量表初筛有痴呆，HIS缺血指数≥7分；NC组65例，男39例，女26例，平均年龄(76.3±6.6)岁，全部为正常健康老年人。

1.2实验方法

1.2.1DNA扩增：常规酚提取法提取外周血DNA，PS-1基因5号外显子体外扩增采用聚合酶链反应(PCR)方法。参考文献^［3］合成引物：上游为5’-GTGGTAATGTGGTTGGTGAT-3’，下游为5-CCCAACCATAAGAAGAACAG-3’。反应体积25 μL，含有模板DNA50～100 ng,0.2 mmol/L dNTP，上下游引物各0.2 μmol/L,50 mmolKCl, 1.5 mmol MgCl₂，10 mmol TRIS-HCl(pH8.3)， 1 U Taq DNA聚合酶。PCR反应条件：95℃预变性5 min，然后按94℃30 s、58℃ 45 s、72℃ 30 s,35个循环，最后72℃10 min。反应结束后，取PCR产物5 μL，加1 μL上样缓冲液，于1.2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外分析仪上检测PCR扩增产物的特异性。用100 bpDNA Ladder作marker测PCR产物片段大小，5号外显子的扩增长度为260 bp(图1)。

Fig.1PCR products of exon 5 of presenilin-1

1PS-1 5号外显子PCR产物电泳图

1.2.2单链构像多态性(SSCP)分析：取PCR产物8μL加上样缓冲液(90%去离子甲酰胺、0.05溴酚蓝、0.05二甲苯晴蓝)等量，97℃变性10 min，骤冷，10分钟后上样于10%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺为29∶1)电泳，200 V恒压，20 mA电流条件下电泳24 h。银染。观察变性后的二条单链电泳迁移率，比较AD病人、VD病人和正常对照者有无不同。

1.2.3DNA序列分析：采用ABIPRISM 310全自动基因分析仪分别对正常对照者、4名SSCP泳动异常及无SSCP泳动变位的AD患者的PCR产物直接进行DNA序列分析。

2结果

SSCP分析结果发现，68名SAD患者中，有4名患者电泳显示一条单链，提示在这些患者的PS-1基因第5号外显子上可能存在某一共同的突变点。用基因分析仪分别对SSCP泳动异常、无SSCP泳动变位的SAD患者及正常人的PCR产物进行DNA序列分析发现：有SSCP泳动异常的SAD患者130号密码子发生CTG→ATG突变(388位点发生C→A突变)，使其编码的氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu130 Met)；157号密码发生了GTG→CTG错义突变(469位点发生G→C突变)，使编码氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸(Val 157 Leu)。另有11名患者SSCP表现为一条单链增快，其性质待定。在其他SAD患者、VD患者和正常对照者中SSCP电泳均显示二条单链，无泳动异常。SSCP结果见图2，DNA序列分析结果见图3～图5。

Fig.2The result of PCR-SSCP

M:marker; a、 b: normal; c、d、e:mutations in patients with AD

2PCR-SSCP结果

M为marker; a、b正常人；c、d、e为发生突变的AD患者

Fig.3Sequencing results of exon 5 of presenilin-1 in normal

3正常人PS-1 5号外显子DNA测序结果(从正向测序)

Fig.4Sequencing results of exon 5 of presenillin-1

in mutational patients with AD

4发生突变的AD患者PS-1 5号外显子DNA

测序结果(从反向测序)

Fig. 5Sequencing results of exon 5 of presenillin-1

in mutational patients with AD

5发生突变的AD患者PS-1 5号外显子DNA

测序结果(从正向测序)

3讨论

本实验利用PCR-SSCP和DNA直接测序技术发现4名SAD患者PS-1基因第5号外显子130号和157号密码子发生了突变。由于130号密码子编码早老素蛋白的第二个疏水跨膜区，此处为早老素蛋白的重要功能区，故考虑发生在此处的突变为病理突变。

早老素的发现，是近年来AD分子遗传学研究领域取得的一个新的进展，许多研究资料表明，早老素基因突变是AD发病的致病基因。目前，在不同种族的40多个家系中已发现PS-1基因的20多种不同突变^［3］，多数发生在PS-1基因的第5、第8号外显子。第5号外显子编码早老素蛋