摘要：目的细胞因子TNF、IFN等在淋巴细胞介导胶质瘤细胞凋亡方面的作用和特点。方法采用免疫组化、分子生物学、MTT法及PBL对培养的胶质瘤细胞凋亡形成的直接观察方法。结果正常人PBL对U-251MG的杀伤活性明显高于TNF或IFN的单独作用，IFN+PBL组对U-251MG的杀伤作用较PBL及TNF+PBL组的杀伤作用凋亡细胞很少而核分裂相细胞多；PBL+IFN组出现大量肿瘤细胞凋亡。结论细胞凋亡调节失常是慢性增殖性肿瘤形成并发展的主要原因。从免疫活性细胞可以通过促凋亡方式抗肿瘤以来，如何通过调节免疫系统预防和治疗肿瘤已成为目前研究的热点。认为MTT法检测PBL介导胶质瘤细胞凋亡有特殊意义。在淋巴细胞抗肿瘤过程中介导释放IFN使肿瘤细胞TNFR及FasR表达增强，同时通过胞浆中的穿孔素，颗粒酶的释放导致肿瘤细胞凋亡。TNF引起的肿瘤杀伤作用是与TNFR相关的FasR介导的。FasL及抗Fas抗体与Fas集合后导致细胞凋亡。

中图分类号：739.41文献标识码：A文章编号：1003-2754(2000)04-0224-03

The effect of cellular factors on glioma cell apoptosis induced by lymphocyte

JU YanKANG Jian-minZHANG Pei-zhuoet al.

（Department of Neurosurgery,The First Teaching Hospital of Norman Bethun University of Medical Sciences,Changchun,130021,China）

Abstracts:ObjectiveTo investigate the effect of cellular factors on glioma cell apoptosis induced by lymphocyte. MethodsUsing immunohistochemical,moleculobiological;MTT and direct observating methods to study combine cultured glioma cells;lymphocyte and cellular factors in first 4 hour. ResultsThe killing activity of normal human PBL to U₂₅₁MG is much higher than TNF or IFN. IFN plus PBL group is the best one,the effect is better than PBL and PBL plus TNF,difference striking(P＜0.05). Contral group has rare apoptosis cells but tumor cell apoptosis. ConclusionLymphocyte release IFN which increase the tumor cells TNFR and FasR expretion,at the same time,perforin and granulin release from plasma and make tumor apoptosis. TNF induce tumor cell wounded is related to TNF and FasR. FasL and antifasantibody connected with Fas and lead to tumor cell apoptosis. It is very significante that using MTT method to research glioma cell apoptosis induced by PBL.

Key words:Glioma;Apoptosis；Lymphocyte；Cellular factors.▲

由于胶质瘤是一种难以根治的肿瘤，放疗、化疗和手术治疗都不能最终制止复发，近年来人们逐渐把目光转移到生物治疗上来，以期从致病因子及免疫系统抗肿瘤的角度，采取最有针对性的抗肿瘤措施。最近研究发现，Fas是触发胶质瘤细胞凋亡的受体，是TNF/TNFR的超家族成员，正常脑细胞不表达Fas，但当发生肿瘤时Fas出现表达，而且已发现，目前的多种抗肿瘤措施均与Fas介导的细胞凋亡有关。近期研究提出，肿瘤细胞Fas表达增强与免疫活性细胞释放gamma-IFN有关。为模拟TNF及IFN在体内的作用，即在细胞因子存在下PBL的抗肿瘤作用，并观察其短程作用特点，本文设计了三者共同作用4h对肿瘤杀伤效应的检测方案，以消除长时间作用后肿瘤细胞大量增生对实验结果的偏差。为探明淋巴细胞抗肿瘤的机制提供有益的线索。

1材料与方法

1.1细胞系人脑胶质瘤细胞系U-251MG，由日本东京大学引进。人周围血淋巴细胞，采自正常献血者周围静脉(AB型血)。

1.2PBL分离分层密度梯度离心法。(Ficoll-Urografin分层液法)：

细胞记数及活力观察采用Trypan Blue法。)

1.3U-251MG细胞形态观察法(1)支持物原位培养HE染色法；因为凋亡细胞胞体缩小与附着物结合力降低，极易脱落，而本法由于蛋膜纤维面与细胞附着牢固，并有网络作用，凋亡细胞不易脱落，容易观察。(2)培养细胞的AO荧光染色法(Acridine Oringe)；AO对DNA与RNA分别染色为翠绿色与火红色荧光，凋亡细胞核为亮绿色荧光。

1.4MTT法检测U-251MG增殖活力MTT法Mosmann根据活细胞及增殖细胞将黄色的MTT［3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl)2.5-diphenyl tetrazolium bromide］在线粒体脱氢酶的作用下还原为蓝色的甲簪(Formazan)，从而推测细胞浓度。

1.4.1不同细胞浓度对OD曲线的影响目的是MTT法依从性，按倍增稀释法，将细胞稀释为4×10⁵，2×10⁵，1×10⁵，5×10⁴，2×10⁴，1×10⁴，5×10³，2×10³，1×10³各设3个平行孔，MTT检测。

1.4.2MTT加入时间及孵育时间的确定：(1)将上述各浓度细胞依次加入96孔板同时加入MTT10μl/孔，分别培养1h、4h、16h 3组，各设3个平行对照。目的是确定加入MTT后的检测时间对结果的影响。(2)将上述各浓度细胞依次加入96孔板，分别培养8h、16h后加入MTT10μl/孔按(1)中最佳孵育时间后检测，以确定加入MTT最佳时间。

方法加入MTT培养一定时间后倒置显微镜下可见大量针状蓝色甲簪形成。倾去上清加20%SDS-HCL 100μl 37℃过夜(使甲簪完全溶解)用免疫酶联检测仪于595nm，630nm检测OD值，二者相减取平均值，细胞活力按下公式计算。

细胞数在2×10-5～4×10-3/ml范围内加入MTT培养4h测定值有良好的直线关系。以下各实验组按效：靶=10∶1(效应细胞10～5/ml，靶细胞10～4/ml,二者之和均在直线范围内)加入MTT孵育4h测定。

1.5实验分组按gamma-IFN、TNF-alpha在人体应用最大血清浓度。

1.5.1PBL对U-251MG杀伤组。

1.5.2gamma-IFN对U-251MG杀伤组。

1.5.3TNF-alpha对U-251MG杀伤组。

1.5.4gamma-IFN+TNF-alpha对U-251MG杀伤组

1.5.5IFN+gamma-IFN对U-251NMG。

1.5.6PBL+TNF-alpha对U-251MG。

1.5.7PBL+IFN+TNF对U-251MG。

以上均设等量靶细胞效应细胞未加药物的对照孔，以及培养基空白对照孔5组。实验因素U-251MG抑制效应又以下公式计算。

2结果与分析

2.1被测细胞数，MTT加入及孵育时间对OD曲线的影响。活细胞代谢MTT产生蓝色甲簪的量，反映了细胞的增殖活性，MTT加入后短时间内无明显的细胞毒性，因此在MTT加入后仍可持续增殖。2h后检测MTT，由于分离种植后U-251MG有短期附壁及潜伏期(Latent phase)，此期由于细胞代谢MTT较少OD值偏低，线性差。8h后由于细胞已大量增殖，细胞数目已经明显超过原设计数目，OD值曲线呈高原波，只有在细胞数为2×10⁵～4×10³/ml，MTT加入后培养4h测得的OD值具有良好的直线关系。同理加入MTT过晚OD值曲线明显向上漂移。因此各个实验组采用效靶比(10∶1=10⁵∶10⁴)且均在线性范围内，效靶细胞记数混合后立即加入MTT，4h后终止反应。

2.2TNF、IFN、PBL分别对U-251MG杀伤作用。TNF及IFN均是由免疫活性细胞产生的细胞因子，后来发现人体的其他细胞也可产生。可通过受体直接作用于肿瘤细胞或通过免疫调节作用，提高免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用。正常人PBL对U-251MG的杀伤活性明显高于TNF或IFN作用组，在人体应用最高血清浓度下TNF、IFN对U-251MG的杀伤作用稍高于对照，差异不显著。

2.3IFN、TNF、PBL不同组合对U-251MG的杀伤作用。IFN+TNF、TNF+PBL、IFN+PBL对肿瘤细胞杀伤作用均有所增强，但前两者增强强度与PBL作用组比较差异无显著性，IFN+PBL对U-251MG杀伤作用比单纯PBL及TNF+PBL杀伤作用有所增强，差异有显著性(P＜0.05)，说明IFN明显增强了PBL对肿瘤细胞的杀伤活性。TNF+IFN+PBL组合对U-251MG共同作用较IFN+PBL联合杀伤作用增加不显著(P＞0.05)，说明TNF可能并未与PBL发生协同抗肿瘤作用。

2.4TNF、IFN、PBL对U-251MG促凋亡作用。文献报道指出，培养细胞血清枯竭可导致细胞凋亡，并出现典型的形态学改变，细胞发生凋亡时细胞膜皱缩，伸展的伪足消失与培养板附着力降低，DNA凝胶电泳呈典型的“DNA Ladder”。本组实验观察发生典型凋亡形态学改变的肿瘤细胞并不易与纤维膜脱离(洗脱细胞很少Trypan blue拒染)，能很好地反映凋亡细胞的全体。结果显示，对照组很少有凋亡细胞，并有众多的分裂相细胞。TNF、IFN组可见少量的凋亡细胞并仍见核分裂组。PBL+IFN组出现大量肿瘤细胞凋亡(P＜0.05)。