摘要：目的探讨去势大鼠局灶脑缺血再灌注后灯盏花的保护作用及其可能机制。方法采用线栓法制备去势大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。通过腹腔注射灯盏花、观察组织病理学、NO含量、IL-1及TNF活性的变化；免疫组化方法检测雌激素受体(ER)的表达情况。结果与对照组相比，灯盏花组的脑梗死体积比脑水肿体积、血液中NO含量、IL-1及TNF活性明显降低(P＜0.01)。结论脑缺血后灯盏花具有明确的脑保护作用。其原因可能是通过降低NO、IL-1、TNF起作用。

中图分类号：R743文献标识码：A文章编号：1003-2754(2000)04-0230-03

Protective function of Breviscapini in focal cerebral ischemic-reperfusion injury in rats

LUO Zu-mingSHANG Hui-fangXI Jing,et al.

（Department of Neurology,The First Affiliated Hospital of West China University of Medical Science,Chengdu,610041 China）

Abstract:ObjectiveTo study the protective function and its mechanism of breviscapini after cerebral ischemic reperfusion in ovarivctomized rat. MethodsWe made the local cerebral ischemic reperfusion model with thread embolism of right middle cerebral artery (MCA) of young female SD rats which were bilaterally two weeks ago,determined the pathological change of brain tissue and the change of NO、IL-1、TNF after breviscapini intraperitoneal injected. Immunostaining was used to study the expression of Estrogen-receptor(ER). ResultsThe neurological deficit scores,the infarction volume ratio,the edema volume,level of NO,IL-1 and TNF activity in serum of breviscapini group were significantly decreased as compared with control group (P＜0.01). ConclusionBreviscapini has significantly cerebral protective effect. The possible protective mechanism of breviscapini is by means of inhibiting inflamatory cytokines(IL-1、TNF) and NO releasing.

Key words:SD rat;Cerebral ischemic reperfusion;Breviscapini▲

中药制剂灯盏花以其扩血管、活血化瘀而广泛应用于缺血性脑血管病的治疗^［1］。以往的研究发现灯盏花能抑制缺血大鼠的神经元凋亡，具有明显的脑保护作用^［2］。但是灯盏花在体内雌激素水平衰退状态下是否仍具有脑保护作用目前尚无报道。本文旨在探讨灯盏花在大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤中的保护作用及其可能机制。

1材料与方法

1.1实验动物与分组雌性3月龄SD大鼠30只，体重250～300g，由华西医科大学实验动物中心提供。

1.2动物模型的制备将上述SD大鼠切除双侧卵巢制成去势大鼠模型，二周后采用稍加改良的Nagasawa^［3］法将上述去势大鼠制成MCAO模型。于MCAO后30分钟给药。剂量以体表面积成人剂量计算，每200g大鼠的系数为0.018^［4］。灯盏花注射液(云南生物制药厂)。

1.3方法

1.3.1过量麻醉大鼠，迅速开胸，从右心耳无菌抽到血液10ml行一氧化氮(NO)含量、白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)活性检测备用。然后夹闭腹主动脉，经左心室插管灌注生理盐水50ml，继之灌入温生理盐水配制的2%红四氮唑(TTC，北京福星化工厂)50ml,灌注时大鼠头部浸泡在37℃水中，持续30分钟。尔后灌入4%中性多聚甲醛375ml，滴速每分钟25ml，共持续15min左右，开颅取脑。

1.3.2脑梗死体积及脑水肿体积测定将大鼠整个前脑组织固定，从后至前进行石蜡冠状切片，片厚4μm,每隔1.2mm取一张进行苏木素-伊红(HE)染色。在装有体视学测试系统的光学显微镜下计算梗死面积^［5］。根据Reempts VJ^［6］介绍的公式，结合本文制片的特点作修改后计算缺血区体积和右侧前脑体积，并计算梗死体积比和水肿体积，其公式如下：

水肿体积=样本的梗死侧体积-样本的非梗死侧体积

式中IV(mm³）：梗死区体积，HV(mm³）：右侧前脑体积，VR：梗死体积比,t(mm):同一样本相邻两张切片间的距离，A_i(mm²）：缺血区面积，A_j：同一切片上右侧前脑之面积。1-n为切片号码，其中第k-f张切片包含梗死区脑组织。

1.3.3电镜取材自Bregma点(即前囟点)向后向外1mm顶叶皮层区域取1×2mm大小的组织块，用4%戊二醛在4℃固定，经塑胶包埋后作超薄切片，在透射电子显微镜下观察神经元超微结构改变。

1.3.4雌激素受体免疫组织化学染色及测定在鼠的缺血性损伤侧大脑自Bregma点向后取厚约3mm梗死区脑组织，冠状切片，常规脱水石蜡包埋。然后作5μm的连续冠状切片，作免疫组化染色。采用LSAB法。雌激素受体单克隆抗体［ER(C-311):Cat＃SC-787］美国Santa Cruz 公司产品。二抗、三抗DKO公司(德国)。阴性对照染色用PBS替换ER单抗，阳性对照组织切片用人乳腺癌(浓度1∶50)。测试方法：ER阳性的神经元以胞核和/或胞浆染成棕黄色为确认标准。阳性对照应阳性，阴性对照应阴性。

1.3.5血液中IL-1、TNF活性测定采用生物活性法。rHIL-1、rHTNF(重组人细胞因子标准品)(SIGMA公司)

1.3.6血中NO含量的测定采用硝酸还原酶法。一氧化氮(NO)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3.7统计学方法数据以均数±标准差(±SD)表示，进行t检验。

2结果

2.1组织病理学改变

2.1.1大体改变大鼠脑梗死灶恒定于右MCA支配区，包括皮层及基底节区。对照组再灌注70h后梗死区边缘整齐，无TTC着色区均匀，呈卵圆状。灯盏花组梗死区边缘不整齐，右MCA支配区内有TTC着色块状区域，未见明显梗死灶。假手术组未见梗死灶。

2.1.2光学显微镜下的组织学改变对照组缺血性损伤区见皮层及基底节神经元数量明显减少，排列紊乱，神经毯明显水肿，呈海绵状，脑实质血管周围间隙增宽，脑实质内见凝固性坏死灶和鬼影细胞、嗜神经现象及格子细胞，基底节纤维肿胀、崩解。灯盏花组大脑皮层神经元正常排列结构尚存，但神经元数量略有减少，变性神经元散在，基底节神经纤维束轻度水肿，可见少量固缩神经元。灯盏花与对照组相比大脑皮层ER(+)的神经元无明显差异。

2.1.3电镜示超微结构的改变对照组缺血性损伤区神经元重度水肿，核染色质边聚，内质网明显扩张，线粒体肿胀、嵴断裂消失，部分线粒体破裂，神经元呈不可逆死亡。灯盏花组神经元中度水肿，线粒体轻度水肿，部分内质网扩张。

2.2灯盏花对脑梗死体积比的影响对照组、灯盏花组缺血性损伤区 脑 梗 死体积比分别为 31.27%±1.36% 、18.43%±1.20%。灯盏花组较对照组明显降低(P＜0.01)，提示：灯盏花具有降低脑缺血后梗死体积比的作用。

2.3灯盏花对脑水肿体积(mm³) 的影响对照组 、灯盏花组脑水肿体积分别为 69.63 ±3.90mm³、51.5±5.47mm³。灯盏花组较对照组明显降低(P＜0.01)。提示灯盏花有降低脑缺血后水肿体积的作用。

2.4灯盏花对大鼠血中NO含量的影响假手术组、对照组、灯盏花组血液中NO含量分别为47.1±5.62μmol/L、133.51±8.79μmol/L、78.90±7.42μmol/L。实验组均较假手术组的NO含量明显升高(P＜0.01)，且灯盏花组较对照组明显降低(P＜0.01)。提示：灯盏花能降低脑梗死3d后血中NO的含量。

2.5灯盏花对大鼠IL-1活性的影响假手术组、对照组、灯盏花组血中IL-1的活性分别为0.76±0.05ng/ml、0.96±0.07ng/ml、0.84±0.06ng/ml。实验组均较假手术组的IL-1的活性明显升高 (P ＜ 0.01)， 灯盏花组较对照组明显降低 ( P＜0.01)。提示：灯盏花能降低脑梗死3d后IL-1的活性。

2.6灯盏花对大鼠TNF活性的影响假手术组、对照组、灯盏花组大鼠血液TNF的活性分别为50.65±2.98IU/ml、68.8±1.89IU/ml、62.90±6.33IU/ml。实验组均较假手术组的TNF的活性明显升高(P＜0.01),灯盏花组较对照组明显降低(P＜0.01)。提示：灯盏花能降低脑梗死3d后TNF的活性。

3讨论

3.1灯盏花在脑缺血/再灌注损伤中的作用本实验通过病理学观察发现，对照组缺血再灌注后梗死区病理变化重于灯盏花组，表明灯盏花对缺血性损伤的神经元损伤有保护作用，这与陈康宁等的研究结果一致。

3.2灯盏花对脑缺血/再灌注损伤的保护作用的可能机制本实验结果显示对照组、灯盏花组MCAO后2