摘要：目的研究大鼠脑内Aβ40的沉积与细胞因子S100β表达的关系。方法我们将Aβ40定向注射于大鼠的双侧海马，采用免疫组化方法观察了S100β的表达。结果S100β免疫组化显示，Aβ40处理的大鼠海马区域有细胞因子S100β的表达，而在生理盐水对照组的大鼠海马区未出现S100β的阳性表达。结论结果提示Aβ40可诱导大鼠海马S100β表达。在超过生理性效应的阈值水平之上慢性持续性表达时，S100β可能是一种重要的致病因子，具有神经毒性效应，参与Alzheimer病的病理活动。Aβ40可能是一种重要的病理性刺激因素。

中图分类号：R742文献标识码：A文章编号：1003-2754(2000)04-0206-03

Amyloid-β protein 40 and the expression of S100β in the SD rat brains

ZU Heng-bingCHEN Sheng-diSHAO Jun,et al.

（Department of Neurology,Shanghai Medical University Affilated Jinshan Hospital,Shanghai,200540 China）

Abstracts:ObjectiveTo inquire whether Aβ40 can induce the expression of S100β in the rat brain. MethodTo research the S100β expression after amyloid-β 40 injection,we take use of anti-S100β immunohistochemical staining. Result3-day and 7-day after Aβ40 injection,we conformed extensive S100β immunostaining by immunostaining of formalin-fixed brain sections. In constrast,the hippocampal cells showed no evidence of S100β expression in the control. ConclusionIt indicates that Aβ40 can induce expression of S100β. S100β may be an important pathologenic factor when chronically expressed above some threshold,favors the pathologic changes of Alzheimer^，s disease. The overexpression of S100β may cause toxic effects resting from concentration above the effective range for trophic support. Our outcome conforms that amyloid-β protein(1-40) is a pathological stimulator.

Key word:Alzheimer^，s disease;Amyloid-β protein;Cytokine；S100β；Pathogenesis▲

在β淀粉样蛋白(Amyloid-β protein,Aβ)细胞毒性作用机制研究中人们注意到，阿尔茨海默病(Alzheimer^，s disease,AD)患者脑内存在大量的免疫炎性标志物，包括主要组织相容性抗原Ⅰ型和Ⅱ型产物、补体及其补体调节蛋白、细胞粘附因子、细胞因子及其受体等。新近的资料证实，在AD患者脑内Aβ沉积区及其邻近区域存在大量异常活化与增生的小胶质细胞、星型胶质细胞，同时伴有IL-1α、S100β、IL-6、TNF-α等多种细胞因子的高水平上调表达。研究提示，胶质细胞的活化及其释放的相关细胞因子可能参与了AD脑内的慢性非特异性炎性病理活动。在AD患者脑内Aβ沉积区及其邻AD患者脑内细胞因子及其受体的广泛表达引起人们的密切关注^［1］。为了研究Aβ的脑内沉积与细胞因子S100β上调表达的关系，我们通过β淀粉样蛋白40(Amyloid-β protein,Aβ40)大鼠海马注射诱导Aβ40的局部沉积，采用抗S100β单克隆抗体免疫组化方法研究了两者之间可能的病理学联系，初步探讨了Aβ40在AD发病机制中的病理性意义。

1材料与方法

1.1实验动物普通级SD大鼠24只，雄性，体重250～300克。24只大鼠称重后随机分为两组，即Aβ40处理组(实验组)和生理盐水组(对照组)，每组12只。

1.2手术方法^［2，3］Aβ40干粉剂(美国Sigma公司)于实验前用无菌注射用水稀释成50μM/L,贮于4℃冰箱备用。大鼠用2.5%戊巴比妥(1ml/kg)腹腔麻醉后固定于脑立体定向仪上，实验组向双侧海马CA₁(以 Bregma点为 0点,AP-3.0 mm，ML 1.5mm,DV-3.2mm)、CA₂-CA₃)(Bregma点为0点，AP-4.0mm,ML2.5mm,DV-3.8mm)区双位点注射Aβ40液，每点3μl,速度为0.3μl/分钟，留针10分钟。对照组用等容量生理盐水作相同的处理。术后3d、7d各取6只用4%多聚甲醛心脏灌注后，迅速断头暴露双侧海马，参照图谱切取约1.0×1.0cm大小组织。用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋。

1.3脑组织β淀粉样蛋白染色^［4］切片常规脱蜡、脱水，Freudenthat改良刚果红法染色。

1.4S100β免疫组化法^［5，6］常规脱蜡、脱水，0.1%胰蛋白酶消化60分钟，0.03%H₂O₂甲醇阻断40分钟，每片滴加羊血清50μl室温孵育1小时，每片滴加S100β单克隆抗体(Sigma 公司，1∶2000)50μl室温孵育1小时，PBS冲洗后滴加生物素标记的二抗孵育60分钟，再滴加Streptavidin-Peroxidase液室温孵育10分钟，最后DAB-H₂O₂混合液显色，苏木素复染后封片、观察。每组同时设置阳性、阴性及空白对照。

2结果

2.1刚果红染色在大鼠海马背后侧CA₁、CA₂-CA₃区Aβ40注射部位的石蜡切片上，可见阳性的刚果红染色(图1)，提示海马组织内有Aβ40的沉积。

图1Aβ40注射区邻近部位的刚果红染色(左图，×50);

Aβ40注射区的刚果红染色(右图，×200)

2.2抗S100β免疫组化染色在术后3d的Aβ40处理组大鼠海马组织中，邻近Aβ40沉积的海马组织连续切片上可见广泛棕褐色着染的阳性染色细胞存在。少部分细胞呈胞浆性阳性染色(图2左图)；在术后7d的Aβ40处理组大鼠，其海马组织切片上，大部分的阳性细胞呈胞核性阳性染色(图2中图)，阳性染色细胞的大小存在一定的差异，推测可能与胶质细胞的活化增殖状态不同有关。在对照组大鼠的海马连续切片上，未见明显阳性染色的细胞存在(图2右图)。

图23天S100β免疫组化染色，箭头所指系棕褐色的阳性细胞(左

，×400);7天S100β免疫组化染色，箭头所指系棕褐色的

阳性细胞(中图，×400);对照组S100β免疫组化染色，箭头

所指系阴性染色的海马细胞(右图，×400)

3讨论

本世纪初人们即通过脑病理研究发现，AD患者的脑组织内Aβ的沉积显著增多，并形成大量的老年斑。Aβ是AD患者产生脑血管、脑膜及老年斑等淀粉样变的主要亚单位。近年来的许多实验报道和临床病理资料均提示，Aβ是家族性及散发性AD的共同性病理异常，在AD发病早期脑内即出现Aβ的显著释放增加和(或)沉积增多。基因的遗传型-表型相关性分析表明，FAD患者存在一个共同的病理性异常，在AD患者发病早期即可发现脑内的Aβ释放增多和(或)沉积数量明显增加。散发性AD的病理、神经生化研究亦提示，SAD患者脑内也有Aβ的异常释放增多和(或)沉积增多^［7，8］。

S100β是一种具有促神经生长效应的细胞因子，可以促进神经元的存活和神经触突的生长，正常人主要表达于生长发育期和成年期。资料提示，伴随着衰老过程，S100β的表达水平显著升高，老年期S100β的过度表达可能会增加脑内神经细胞对某些病理性作用因子的易感性。在Down氏综合征(Down syndrom,DS)及AD患者脑内，活化和星形细胞可表达并释放S100β，S100β和S100βmRNA的表达水平均显著升高。资料证实，活化的S100β阳性(S100β⁺)星形细胞是神经炎斑不可缺少的部分，与AD患者脑内的β淀粉样蛋白沉积区域显著相关^［9，10］。

本实验的S100β免疫组化结果显示，在大鼠海马区的Aβ40沉积区域有广泛S100β阳性染色的细胞存在，提示有细胞因子S100β的阳性表达，而在生理盐水对照组的大鼠海马区未出现S100β的阳性表达。资料提示，在DS和AD患者发病的早期即有明显的脑内弥散性Aβ沉积，Aβ的沉积可见于散发性和家族性患者。在老年人、头部外伤者及拳击性痴呆患者脑内亦有异常的Aβ释放与沉积。上述几种情形者均可形成典型的临床痴呆症，且伴有脑内的S100β表达水平均显著升高^{［11，12］}。有趣的是，老年大鼠及头部外伤的大鼠脑内也有S100β的过度表达。上述资料提示Aβ的脑内异常沉积可能具有重要的病理性意义，Aβ沉积与脑内的S100β表达之间也可能存在相关性。

小胶质细胞和星形细胞是脑内具有重要病理效应的细胞群，有研究发现，在AD患者脑组织内Aβ沉积显著增多的大脑前皮质、顶叶、颞叶及海马等易感区域存在大量活化与增殖的小胶质细胞和星形细胞。进一步的研究发现，老年斑及弥