摘要：目的探讨分子血红蛋白(MHb)的生物活性，为该类血液代用品在脑复苏领域的应用提供理论依据。方法采用12～15d胎鼠脊髓神经元进行原代分散培养，观察1、10、50μmol/L不同浓度MHb对神经元形态和活性的影响。结果作用24h时各实验组脊髓神经元均观察到毒性反应，神经元活性也明显低于空白对照组(P＜0.01)。超氧化物歧化酶(SOD)和甘露醇能够抑制MHb的毒性作用。结论氧自由基介导了MHb对脊髓神经元的毒性作用，提示对MHb进行修饰来防止自由基生成的必要性。

中图分类号：R743文献标识码：A

文章编号：1003-2754(2000)03-0165-03

Study on the effects and mechanism of molecular hemoglobin on embryonic mouse spinal neuron in culture

SONG Li-qiang,XIONG Li-ze,WANG Jun,et al.

(Departent of Pulmonology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University Xian 71003 China)

Abstract：ObjectiveModified molecular hemoglobin(MHb)-based oxygen-carrying blood substitutes can lessen the neuronal injury following cerebral ischemia and reperfusion. The prsent study is to examine the biological characteristics of MHb,and provide the theoretic base for the use of MHb-based blood substitutes on cerebral resuscitation.MethodsUsing the neuron suspension in culture prepared from E_12-15mouse spinal cord,the effects of different concentrations (1,10,50μmol/L) of MHb on the morphology and activity of the neuron were determined.ResultsThe toxicity of MHb on spinal neuron in all MHb groups apeared at 24 hours after expopsure to MHb. Moreover,the neuron activity determined could inhibit the toxicity of MHb effectively.ConclusionOxygen free radical mediated the toxicity of MHb on spinal neuron. So it is necessary to modify MHb to prevent the production of oxygen free radical.

Key words：Molecular hemoglobin；Neuron culture；Oxygen free radical；Cerebral resuscitation

脱离红细胞的自由血红蛋白称为分子血红蛋白(molecular hemoglobin,MHb)。1992年Cole等^［1］首次报道，修饰MHb类携氧性血液代用品对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有治疗作用；我实验组在全脑缺血模型也观察到类似的保护与复苏效果^［2］。为进一步了解MHb的生物活性及其与中枢神经元的关系，本实验研究MHb对原代培养胎鼠脊髓神经元形态和活性的影响及机制。

1材料与方法

1.1MHb溶液的制备取0.644g的牛血红蛋白(Sigma)和0.248g硫代硫酸钠(Na₂S₂O₄)溶于适量三蒸水，透析后用DF12配成溶液待用。

1.2细胞培养神经元无血清培养参照Andre等的方法。选择胎龄12～15d昆明种小鼠(E12-15)，无菌取胚胎，在解剖显微镜下小心剥离脊髓，剥净血膜，剪碎组织至1mm³，0.125g/L胰酶消化37℃，25min，用完全培养液终止消化10min。无血清培养用N1培养液洗组织，吹打制成单细胞悬液。分别以1×10⁴细胞/ml、12.5×10⁴细胞/ml接种于Polyormithine(Sigma)处理过的24孔和96孔培养板。37℃、5%CO₂培养箱中培养24h，根据实验分组，分别加入不同试剂，继续培养24h。

1.3实验分组

1.3.1MHb不同浓度组培养板每孔加入MHb溶液，并分别调节终浓度为1μmol/L、10μmol/L和50μmol/L，对照组加入等量DF12溶液。各组实验重复4次。

1.3.2超氧化物歧化酶(SOD，国产)干预组培养板每孔同时加入MHb和SOD溶液，并调节终浓度分别为MHb50μmol/L+SOD(浓度分别1、10、100u／ml)。设等量DF12溶液正常对照及MHb对照组。每组实验重复4次。

1.3.3甘露醇干预组培养板每孔同时加入MHb和甘露醇溶液，并调节终浓度分别为MHb50μmol/L+甘露醇(浓度分别1、10、40mmol/L)。设正常对照及MHb对照组。每组实验重复4次。

1.4形态学观察倒置显微镜下观察24孔板神经元变化。

1.5三唑氮(MTT，Sigma)比色试验继续培养24h，取96孔板各孔加入5mg/ml MTT溶液10μl、100μl二甲基亚砜溶液，在DynatechMR读数仪上测570nm波长下OD值。

1.6统计学处理应用Microsoft公司Excel软件。实验数据以χ±s表示，组间比较采用t检验。

2结果

2.1MHb不同浓度组神经元原代培养24h，倒置显微镜下，细胞分散良好，胞体饱满，折光性强，突起长于胞体直径,各组细胞差异不大。加样后继续培养24h，对照组神经元形态变化不明显;50μmol/L组神经元突起全部消失，无折光性，胞体明显缩小，边界不清，胞浆内出现黑色颗粒，有少量细胞碎片。1μmol/L和10μmol/L组细胞破坏程度接近，神经元突起缩短或消失，无折光性，胞体边界不清。对照组和1、10、50μmol/L组比色测得OD值分别0.092±0.005,0.045±0.009,0.039±0.002,0.038±0.007，各实验组与对照组相比均有显著差异(P＜0.01)。

2.2SOD干预组加样后继续培养24h观察。与MHb对照组相比，SOD10、100u/ml组神经元的破坏程度明显减轻，10u/ml组有少量细胞突起缩短，100u/ml已接近正对照组。SOD1u/ml组神经元的形态变化稍有减轻，部分存活细胞仍保留有短突起，但折光性明显减弱。SOD1、10、100u/ml组和MHb对照组测得OD值分别为0.047 ± 0.008 、 0.063±0.009、0.085±0.001和0.040±0.003,10、100u/ml组与对照组相比有显著差别(P＜0.01)。

2.3甘露醇干预组加样后继续培养24h观察。与MHb对照组相比，全部甘露醇组神经元形态改变明显减轻，仅少数细胞突起缩短，折光性减弱，各浓度组之间差异不明显。甘露醇1、10、40mmol/L组和 MHb 对照组测得OD值分别为0.074±0.005、0.082±0.011、0.077±0.004和0.038 ± 0.008，各实验组与对照组相比均有显著差别(P＜0.01)。

3讨论

3.1MHb对脊髓神经元的毒性作用正常红细胞代谢产生的少量MHb，不能透过血-脑脊液屏障，并很快被血液中触珠蛋白结合，这是机体的一种自我保护机制。而在蛛网膜下腔出血及脑缺血致使血-脑脊液屏障通透性增高等病理过程中，MHb能进入脑脊液。但其对中枢神经元的直接作用尚未见报道。本实验结果显示，MHb对脊髓神经元有明显毒性，细胞表现为突起消失、胞体皱缩、胞膜破裂等改变，活性指标显著下降(P＜0.01)。浓度越高，毒性出现时间越早，细胞破坏程度越重，呈现时间和剂量依赖性。日本Yasumasa^［3］收集6例肌萎缩侧索硬化(ALS)和帕金森综合征(PD)患者的脊髓腰段标本，采用单克隆抗体检测表明，神经元中血红蛋白表达显著高于正常人。提示MHb增多与中枢神经系统疾病的密切关系，与本文结果有着某种一致性。

3.2MHb对脊髓神经元毒性机制的初步研究MHb发生氧化反应时，能够产生系列活性氧自由基，即：MHb-Fe²⁺+O₂→MHb-Fe³⁺+，2+2H⁺→H₂O₂+O₂，H₂O₂+MHb-Fe²⁺→OH^·+OH^-+MHb-Fe³⁺。但在生理情况下，红细胞内存在SOD、CAT和GSH等抗氧化酶系，能阻断氧自由基的产生，维持血红蛋白的还原态和运氧功能^［4］。SOD专门清除，甘露醇则对化学性质最活泼、毒性最强的OH*有特异清除作用。本文干预实验表明，SOD和甘露醇都能抑制MHb对脊髓神经元的毒性。说明这种毒性正是MHb产生氧自由基，发生脂质过氧化的结果。高浓度SOD比低浓度表现出更强的抑制效果，而各浓度甘露醇作用结果相近，似乎反映出OH·比扮演着重要的角色。一些病理研究表明，家族性ALS患者的Cu/Zn-SOD基因突变或酶蛋白活性下降^［5］也是本结论的佐证。

综上可见，本实验从研究MHb和脊髓神经元的关系入手，阐明单纯MHb作为血液代用品应用于脑复苏领域的弊端，指出对MHb修饰来减少氧自由基产生的必要性，而且检测各类修饰MHb对中枢神经元的直接作用也是非常重要的。

基金项目：国家自然科学基金资助课题(39670699)

参考文献

［1］ Cole DJ,Schell RM,Przybeiski RJ,et al. Focal cerebral ischemia in rats:effects<