摘要：目的探讨野生型P⁵³激活片段(WAF₁)在人脑胶质瘤中的表达及与肿瘤病理学的相关性。方法用46例胶质瘤组织及12例脑外伤组织RNA逆转录，然后用PCR定量检测WAF₁ mRNA。结果脑外伤WAF₁ mRNA全部表达，用激光扫描仪检测的总面积及百分面积均大于胶质瘤，两者有显著性差异。胶质瘤WAF₁表达均在病理分级较低级别中。结论WAF₁的有无表达及定量多少可以作为判断脑胶质瘤恶性程度及预后的一个指标。

分类号：R739.41文献标识码：A

文章编号：1003-2754(2000)01-0039-02

Fax quantity measure of WAF₁ in human glioma and studies of an interaction between WAF₁ expression and tumor pathology

ZHAO GangZHU Xiao-boYAN Xi-min

(Department of Neurosurgery,The First Teaching Hospital of Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021,China)

Abstract：ObjectiveTo quantitatively measure the expression of WAF₁ in human glioma and identify a pathological interaction between the expression of WAF₁ and the grade of alignancy.MethodsUsing the method of RNA reverse transcription to manage 46 brain gliomas and 12 brain contusion,then quantitatively measure WAF₁ mRNA of them with PCR.ResultsAll brain contusion show WAF₁ mRAN,both total area and precent area of brain contusion measured by laser scanner are bigger than them of glioma.There are significant difference between the two groups. All the expression of WAF₁ in human glioma show in the low-grade tumors.ConclusionWhether or not glioma express WAF₁ and numbers of WAF₁ expression may be targets that judge the malignant degree and prognosis of glioma.

Key words：Human glioma;WAF₁;Ration;Pathology▲

肿瘤分子学研究表明，癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤发生发展的重要机制。野生型P⁵³激活片段(Wild Type P⁵³-Activated Fragment，WAF₁)是抑癌基因之一,它是由Vogelstein及其同事1993年^［1］在寻找受P⁵³转录调控的基因中发现的。我们已通过实验证实，正常脑组织中含有抑癌基因WAF₁，而在人脑胶质瘤中则根据肿瘤恶性程度的高低，WAF₁呈现部分或完全缺失^［2］。在此研究的基础上，我们又进一步对WAF₁进行了定量检测，并对其存在状态与胶质瘤临床病理学相关性进行了探讨。

1材料与方法

1.1研究对象收集我科1996年5月～12月间46例脑胶质瘤手术切除标本为研究组，其中男22例，女24例。平均年龄38.5岁；12例脑外伤标本为对照组。

1.2胶质瘤病理诊断及分级星形细胞瘤Ⅰ级3例、Ⅱ级16例、Ⅲ级13例、Ⅳ级4例；髓母细胞瘤4例；室管膜瘤4例；原始神经外胚叶瘤2例。其中4例复发病例，复发后的病理诊断较首次诊断级别增加。

1.3主要实验仪器及试剂DNA扩增仪，透射式紫外分析仪，低温台式离心机，水平电泳装置，激光密度扫描仪，AMV逆转录酶，γ-肌动蛋白基因引物^［2］，人WAF₁编码区引物^［2］。

1.4实验方法

1.4.1组织mRNA的提取每管取100～500μg胶质瘤及正常脑组织，剪碎，依次加入0.7ml CSB液、70μl乙酸钠、0.7ml 1∶1酚和氯仿，震荡10s，置冰上15min，低温离心15min，0.5ml CSB液悬浮，等体积异丙醇沉淀，相同条件再次离心，75%冷乙醇洗1次，每管加DEPC水悬浮沉淀。

1.4.2QRT-PCR方法检测WAF₁逆转录体积20μl，RNA液5μl,加5倍逆转录缓冲液，置75℃ 5min，依次加入dNTP 20ml、Rnasin 1.0μl、AMV逆转录酶2.0μl,11 000r/min离心5s，置42℃ 90min，15℃ 5min。PCR反应体积为50μl,5倍缓冲液10μl,dNTP 4.0μl,WAF₁引物5.0μl,γ-肌动蛋白基因引物2.0μl，RDDNA聚合酶1.0μl，加水3μl,混匀，每管分装45μl，加入5.0μl逆转录液，上层加25μl液体石蜡，离心5s，置PCR仪上扩增30个循环，加71℃ 300s，取5μl PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下拍照。用激光扫描仪测WAF₁和γ-肌动蛋白基因DNA PCR扩增带的总面积与百分面积。

1.5统计学处理采用χ²检验和t检验对实验结果进行统计学分析。

2结果

46例胶质瘤中14例有WAF₁表达，表达率为30.4%，对照组脑外伤12例全部表达，表达率为100%。用激光扫描仪检测WAF₁和γ-RN动蛋白基因DNAPCR扩增带密度比值得出总面积及百分面积：脑胶质瘤总面积为3.27，脑外伤为5.68;百分面积前者为19.8，后者为37.2，两组比较有显著性差异(P＜0.05)。

WAF₁在胶质瘤中的表达与病理组织学类型有关。星形细胞瘤Ⅰ级3例均有表达，Ⅱ级16例9例表达，Ⅲ级13例、Ⅳ级4例均无表达，室管膜瘤4例中有2例表达，髓母细胞瘤4例、原始神经外胚叶瘤2例均无表达。脑外伤标本则全部表达。胶质瘤与脑外伤组比较有显著差异(P＜0.01)。

3讨论

WAF₁是由P⁵³诱导的一种潜在的抑癌基因。野生型P⁵³可直接与WAF₁结合，而活化WAF₁基因转录，WAF₁基因编码蛋白P²¹是一系列在G₁/S期起活性作用的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的抑制剂。因此人们认为野生型P⁵³是通过活化WAF₁基因转录而抑制细胞周期进程的^［3］。WAF₁新基因的发现可以帮助我们了解抑癌基因抑制肿瘤细胞生长功能的分子机制。EI-Deiry等人在酵母上发现，P⁵³基因能够促使WAF₁基因的蛋白表达，这个新基因的蛋白产物能和细胞周期依赖性激酶结合并抑制该酶的作用，在细胞分化之前使细胞停滞在中期，结果细胞有足够的时间进行DNA修复，从而阻止被损伤DNA的复制，抑制细胞癌变。

近年来，国外学者对WAF₁在胶质瘤中的表达情况进行了多方研究^［4～7］，但尚无定量方面的报道。本实验应用逆转录PCR技术检测WAF₁在胶质瘤中的定量以及表达，结果显示：WAF₁在胶质瘤分化较好的即病理分级较仪的组织中有表达^［8］，表达率为30.4%，而随着肿瘤恶性度的增高WAF₁无表达，对照组表达率为100%；用激光扫描仪检测WAF₁的量，对照组亦明显高于胶质瘤组。可以看出，胶质瘤中WAF₁的表达均在星形细胞瘤Ⅰ、Ⅱ级病例中，而临床上生存状态较好的亦为星形细胞瘤Ⅰ或Ⅱ级，因为它们介于良恶性之间，故表达定量多少也介于星形细胞瘤Ⅲ、Ⅳ级及其它恶性度高的肿瘤与正常脑组织之间，说明胶质瘤中WAF₁不单有质的变化而且有量的改变。故可以认为WAF₁存在于正常脑组织及恶性度低的星形细胞瘤Ⅰ、Ⅱ级组织中，但随着局部细胞的增殖、分化，使WAF₁的含量逐渐减少或失活，而癌基因逐渐增加或激活。当组织WAF₁的量减少到不足以抑制细胞增殖时，则肿瘤从低恶性度向高恶性度转化，并增加了肿瘤复发的机会。本组46例胶质瘤中有4例复发病例，首次手术肿瘤病理分级均为星形细胞瘤Ⅰ级，至肿瘤复发，再次手术其病理分级已达Ⅲ级以上。所以，WAF₁的有无表达及定量多少可以作为判定胶质瘤良恶程度及预后的一个标准，也是肿瘤是否复发的重要信号。

参考文献：

［1］EI-Deiry WS,Tokino T,Vogelstein B,et al. A potential P⁵³ tumor suppression［J］. Cell,1993,75：817-819.

［2］孙庆林，赵刚，徐寿水.人脑胶质瘤WAF₁/CIP₁表达的研究［J］.中风与神经疾病杂志，1998，15(3)：151-153.

［3］Harpeer JW,Adami GR,Wei N,et al. The P²¹ CDK-interacting protein Cip is a potent inhibitor of G₁ cyclin-depandent lcinases［J］. Cell,1993,75：805-807.

［4］Deng C,Zhang P,Harper JM,et al. Mice lacking P²¹ CIP₁/MAF₁ under go normal development but are defective in G₁ checkpoint contral［J］. Cell,1995,82：657-659.

［5］Waldman T,Kiniler KW,Vogelstein B. P²¹ is necdssary for the P⁵³-medinted G₁ arrest in human canceal cells［J］. Cancer Res,1995,55：5187-5188.