摘要目的探讨细胞共同抗原CD₄₅RB在缺血性脑损伤中作用。方法选用SD成年大鼠阻塞大脑中动脉2h，再灌流0.5～48h制成短暂局灶性脑缺血，用CD₄₅RB对缺血性脑组织进行免疫组化染色。结果正常组及假性手术组的脑组织有散在的神经元弱表达CD₄₅RB。缺血脑组织，皮质层锥体细胞、纹状体及下丘脑区的神经元CD₄₅RB强阳性，其胞核形态及对苏木素着色均正常；轻度变性的神经元弱表达CD₄₅RB；细胞核固缩死亡的神经元CD₄₅RB阴性。结论本实验证实CD₄₅RB在缺血时形态正常的神经元呈强表达，其重要意义尚需进一步研究。

The expression of leukocyte common antigen CD₄₅RB in neurons after transient focal ischemia in rat

Yuan Qionglan,Li Ruixiang,Yang Huijun,et al.

Department of Anatomy,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041

AbstractObjectiveTo observe the role of CD₄₅RB in transient focal ischemia in rat.MethodsThe focal ischemia was made by occluing the middle cerebral artery for 2 hours and reperfusion 0.5～48 hours.The ischemie brain tissue was studied by monoclonal antibody against CD₄₅RB.ResultsThe scattered neurons weakly expressed CD₄₅RB in normal and sham-operated animals.Following transient focal cerebral ischemia,CD₄₅RB was strongly induced in larger pyramidal neurons of cortical as well as the bigger neurons of striatum,hypothalamus.The nuclear shape and hematoxylin stainning of CD₄₅ positive neurons were normal;the slightly degenerative neurons weakly expressed CDRB;the dead neurons didn^，t expressed CD₄₅RB.ConclusionThe data conformed that the normal neurons based on morphology strongly expressed CD₄₅RB.The significance of CD₄₅ expression in neurons after transient focal cerebral ischemia needs to be investigated.

Key wordsNeuronCD₄₅RBFocal transient ischemiaRat

白细胞共同抗原CD₄₅(LCA)由一类结构相似，分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面，其胞浆区段具有蛋白质酪氨酸磷酸酶的作用。能使底物P^56LCK和P^59FYN上酪氨酸而激活，在细胞的信息传导中发挥重要作用。CD₄₅是细胞膜上信号传导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟、功能调节及信号传递中具有重要意义^［1］。已有的研究表明CD₄₅RB存在于人胚胎发育时期各种形态的小胶质细胞^［2］，可作为研究小胶质细胞发育分化的标志。本实验研究证明CD₄₅RB在神经元也有表达。

1材料与方法

1.1试剂与材料CD₄₅RB的单克隆抗体(Dako,Rb PD7/26,code No,M0883),ABC试剂盒(Vector)，多聚L赖氨酸(Sigma)，其余化学试剂为国家分析纯。直径2.0mm尼龙线，SD成年雄性大鼠29只(250～320g),购自华西医科大学实验动物中心。

1.2动物模型制备及分组动物模型采用改良的可逆性大脑中动脉阻塞法制备^［3］。将出现神经症状的大鼠随机分为再灌流0.5h组(3只)，3h组(5只)，6h组(5只)，12h组(4只)，24h(5只)，48h组(4只)。假性手术对照组(3只)，阻塞线长1.5cm，不能阻塞大脑中动脉，不出现神经症状，术后24h处死。正常组2只，大鼠不做任何处理。实验组、假性手术组、正常组动物用戊巴比妥纳过量麻醉处死动物，开胸经主动脉插管，夹闭胸主动脉，快速依次灌注生理盐水 150ml，4℃ 4%多聚甲醛200ml (0.1mol/PBS 配制，pH7.3)后，迅速取脑，在前囟及前囟后4.0mm处将脑冠状切成三部分，置4℃相同的固定液中后固定过夜。石蜡包埋，切片厚5～7μm。

1.3免疫组织化学按ABC法程序进行。石蜡切片脱蜡、梯度酒精水化，0.3%H₂O₂-甲醇，室温15min，0.1%胰蛋白酶37℃，30min，5%羊血清37℃，30min后直接滴加抗CD₄₅RB(1∶50)抗体，4℃，18～20h，生物素化二抗(1∶200)，37℃，2h，过氧化酶标记的ABC复合物(1∶100)，37℃，2h，DAB呈色，上述各步之间用0.01mol/L PBS pH7.3,洗3×5min，苏木素复染，脱水透明，封片。光镜观察结果∶阳性对照实验用0.01 MPBS代替一抗CD₄₅RB，其余相同，结果阴性。

2结果

正常组及假性手术组、实验组对照侧，大脑皮质层有散在的CD₄₅RB阳性的锥体神经元，其胞质和轴突为弱阳性，丘脑、下丘脑区及中间隔核亦有少量的CD₄₅RB阳性的神经元(图1)。缺血2h，不同的再灌流实验组，可见CD₄₅RB阳性的神经元，广泛散在分布于大脑皮质Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、海马、纹状体、丘脑和下丘脑区。CD₄₅RB阳性的神经元的特点：免疫反应主要位于胞质，DAB呈色为强阳性，胞体大呈锥体形(皮质及海马的锥体细胞)或卵圆形(丘脑及下丘脑区)，苏木素复染显示其细胞核的形态、着色均正常。在缺血损伤区，轻度变性的神经元DAB呈色为弱阳性，但苏木素显示细胞核固缩为杆形或梭形的死亡神经元CD₄₅RB免疫反应为阴性(图2，3)。

图1假手术组，侧脑室隔核CD₄₅RB阳性的神经元()×400

图2再灌流24h，皮质轻度变性的神经元CD₄₅RB弱阳性 ×400

图3再灌流48h，丘脑区神经元胞质、胞核CD₄₅RB强阳性 ×400

3讨论

目前的研究认为白细胞共同抗原CD₄₅RB对淋巴细胞生长、增殖、功能活化等过程具有重要意义。迄今为止，国内外尚无报道CD₄₅RB在神经元的表达。作者在研究人视网膜小胶质细胞发育时，相同的抗体标记出各种形态的小胶质细胞，视网膜的神经元不表达CD₄₅RB。由于小鼠CD₄₅RB的同源性高达89%^［4］，因此该抗体完全可用于大鼠脑组织的研究。正常组、假性手术组，大脑皮质大型锥体细胞胞质弱表达CD₄₅RB，缺血后在组织结构完整，无缺血性损伤区如海马、丘脑处及缺血区神经元形态未见异常，胞核形态、着色正常的神经元强表达CD₄₅RB，而缺血性损伤的神经元不表达CD₄₅RB。这一结果提示CD₄₅RB在神经元的表达对神经元可能具有保护作用。来源、分化、功能与淋巴细胞完全不同的神经元在缺血后强表达CD₄₅RB，其重要性有待更进一步研究。缺血后活化的小胶质细胞形态变化与神经元损伤的程度相一致，故推测小胶质细胞与神经元之间存在信息分子，调节两者的功能活动。缺血后活化的小胶质细胞亦强表达CD₄₅RB(另文报道)，因此CD₄₅RB是否作为信息分子调节及如何调节小胶质细胞与神经元的活动尚待研究。

参考文献

1 李鸣.白细胞共同分化抗原CD₄₅.国外医学分子生物学分册，1995，17(30)：112.

2 袁琼兰，羊惠君，李瑞祥.人视网膜小胶质细胞形态及分布的免疫组化研究.四川解剖学杂志，1998，6(2)：99.

3 袁琼兰，李瑞祥，羊惠君，等.改良的短暂局灶性脑缺血模型.四川解剖学杂志，1998，6(2)：63.

4 Streuli M,Krueger NX,Hall LR,et al.A new member of the immunoglobulin superfamily that has a cytoplasmic region hemologus to the leukocyte common Antigen.J Exp Med ,1988,168:1553.

(1998-02-21收稿)