摘要目的探讨丹参对单侧颞叶缺血性损害大鼠空间认知能力的改善作用及与热休克蛋白32(HSP32)表达的关系。方法采用立体定向光化学技术导致大鼠左侧颞叶皮层梗死，术前30分钟及术后第3天分别给丹参组大鼠腹腔注射丹参10g/kg,用Morris水迷宫监测大鼠行为。然后取脑进行HE染色及HSP32免疫组化分析。结果丹参组大鼠在Morris迷宫中搜索目标的反应时和行程较单纯梗死组显著缩短，且较多地使用了正常的认知策略，其由随机式过渡到趋向和直线式策略的进程也与正常对照组无明显差异。丹参治疗组颞叶梗死体积较单纯梗死组显著缩小，HSP32表达明显减少。结论丹参可以明显改善单侧颞叶缺血性损害大鼠的空间认知能力障碍。HSP32表达与颞叶损害有关联。

Radix salviae miltiorrhizae(RSM) could improves spatial cognition of rats with left cerebral temporal infarction and expression of HSP32

Jiang Shujun,Wu Weiping,Kuang Peigen,et al

(The Laboratory of Neurotransmitter,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853)

AbstractObjectiveEffects of radix salviae miltiorrhizae(RSM) on spatial cognition of rats with left cerebral temporal infarction were investigated in Morris water maze task and the expression of HSP32 were investigated in Morris water maze and by immunohistochemistry．MethodsSelective left temporal infarction of rats was induced by the cold light and RSM group was treated 30 minutes before and 3 days after the operation．Morris water maze and Morris maze experimental assistant system were used to monitor the behavior．Then the rat brains were analysed by HE and immunochemisty of HSP32．ResultsRSM reduced the reaction time and distance of this kind of spatial learning test．Moreover,the rats of RSM group used normal strategies more often,and the strategies changed faster than that of the damage group．RSM reduced the size of the infarction and down-regulated the expression of HSP32．ConclusionRSM could improve spatial learning ability of rats with temporal infarction．The down-regulation of the expression of HSP32 probably is related to the neuroprotective mechanism.

Key wordsRadix salviae miltiorrhizae (RSM)Cerebral infarctionSpatial learningMorris water mazeHSP32Rat

丹参除了减轻脑水肿、抑制血栓形成外，还可以明显改善大鼠脑缺血后单胺类神经介质的紊乱、调节血管活性肠肽和P物质及兴奋性氨基酸的含量、清除自由基、降低NO含量、下调c-fos基因表达、使热休克蛋白70(HSP70)及bFGF样免疫反应增强等^［1～5］。但脑缺血后，丹参对行为障碍的改善作用尚缺乏研究。我们以前的工作显示丹参可以改善颞叶梗死大鼠在Y型水迷宫和跳台实验中的记忆能力，但对空间学习能力的作用尚不肯定^［6］。因此本实验采用更为先进的Morris迷宫研究丹参对大鼠空间学习障碍的改善作用。近年来发现缺血和氧自由基能在脑内诱导热休克蛋白32(HSP32)表达，其催化降解血红素生成的胆色素和CO具有生物活性^［7］。因此我们观察了丹参对颞叶梗死局部HSP32表达的影响。

1材料和方法

1.1实验动物及分组成年雄性Wistar大鼠(北京医科大学动物中心提供)27只，实验起始体重200±20g，随机分为3组，梗死对照组10只、丹参组7只、假手术组10只。实验期间摄食饮水自由，全部行为训练都在10:00～17:00之间完成。行为实验结束后，取脑进行HE染色及HSP32免疫组化分析。

1.2动物模型的制备采用立体定向光化学诱导脑梗死技术。将大鼠麻醉后，固定在立体定位仪上，从尾静脉注射玫瑰红(RB，20mg/kg)，切开头皮，确定颞叶位置，用光导纤维引导冷光，定向照射与左侧颞叶相应的裸露颅骨20min，造成局灶性颞叶梗死^［8］。术前30min给丹参组大鼠腹腔注射丹参(10g/kg,北京第四制药厂生产)，梗死对照组则注射同等剂量的生理盐水。术后第3天给丹参组大鼠追加注射同等剂量的药物。假手术组大鼠仅进行了麻醉和手术切口。术后局部抗感染。

1.3行为实验各组大鼠从术后第4天开始Morris水迷宫行为实验，连续5d。实验分为两个阶段：预训练(1d)及训练(4d)，大鼠共接受训练24次，每天6次，每次间隔15min。大鼠在除站台外的其它3个象限边缘头朝池壁入水，每次入水位置是假性随机的。图像自动监视系统自动追踪大鼠游泳轨迹，并记录各项实验数据。实验指标有：(1)反应时(s)；(2)行程(cm)；(3)搜索策略。反应时、行程以3次训练成绩为1个组次取平均值，训练4d，共8个组次。实验数据采用SPSS软件包进行方差分析和X²检验。本实验中各组大鼠的平均反应时和搜索行程在第5～8组次时已十分接近，因此在图1和图2中各数据仅标至第5组次。

图1各组大鼠在第1～5组次平均反应时的变化

图2各组大鼠在第1～5组次平均搜索行程的变化

1.4大鼠颞叶HE染色及免疫组化分析行为实验结束后，麻醉、灌注、取脑固定、脱水，从视交叉开始行30μm厚连续冠状切片。切片分2组：一组行HSP32(中山公司)免疫组化染色，相邻一组行HE染色。

2结果

2.1行为实验结果

2.1.1反应时的比较梗死组、丹参组及假手术组大鼠各组内的组次间平均反应时差异均具有显著性(F值分别为7.53、3.67、7.70，P均＜0.001)，各组大鼠的反应时均随学习组次的增加而缩短，在第5组次时3组的反应时已十分接近。组间比较发现，各组大鼠在第2组次的平均反应时具有显著性差异(F=3.67，P＜0.05)。进一步两两比较可见，在这一组次梗死组与假手术组、丹参组大鼠相比差异均具有显著性，而丹参组和假手术组之间无显著差别(见图1)。

2.1.2行程的比较梗死组、丹参组和假手术组大鼠各组内组次间的平均搜索行程具有显著性差异(F值分别为6.51、3.67、5.52，P均＜0.001)，总的趋势是随着学习组次的增加搜索行程逐渐缩短，至第5组次时各组的行程已十分接近。各组在不同时间点进行比较时发现，大鼠在第2组次的搜索行程具有显著性差异(F=6.02，P＜0.001)，进一步两两比较可见，梗死组与假手术组、丹参组大鼠相比差异均具有显著性，而丹参组和假手术组大鼠间无显著差别(见图2)。

2.1.3搜索策略的比较各组大鼠所使用的策略与处理有关，丹参组大鼠较多地使用了趋向式和直线式策略，梗死组大鼠则以随机式策略为主(χ²=15.74，P＜0.01)。进一步分析发现，丹参组和假手术组大鼠在第3～4组次时趋向式策略已较多，第5～6组次时梗死组大鼠的搜索方式由随机式为主变为由趋向式为主，而假手术组则以趋向和直线式居多，且具有显著性差异(P＜0.001)，第7～8组次时各组大鼠的直线式策略均增多，组间没有明显差别(见图3)。

图3各组大鼠在第1～8组次趋向和直线式策略的变化

2.2HE染色每组取4只鼠脑，通过系列HE染色切片，计算梗死体积，发现梗死组和丹参组左侧颞叶皮层存在梗死灶，梗死灶中心点位于视交叉后4.8±0.5mm，假手术组无梗死灶。丹参治疗组梗死体积较单纯梗死组缩小，经方差分析两者间差异显著(P＜0.01)。

2.3免疫组化分析HSP32免疫组化检测发现，在梗死灶及周边脑组织HSP32表达，其中单纯梗死组HSP32表达最多，丹参治疗组减少，假手术组无HSP32表达。

3讨论

我们所使用模型的机理是光化学物质玫瑰红遇到光线后，发生光化学反应，释放自由基损伤血管内皮，引起脑梗死^［8］。从本实验丹参能显著缩小颞叶皮层梗死体积来推测，丹参可能在此模型上通过抑制血栓形成发挥治疗作用。行为研究结果表明，丹参组大鼠在Morris迷宫中搜索目标的反应时和行程可以显著地缩短，同时与梗死组相比，丹参组大鼠较多地使用了正常的认知策略，由随机式过渡到边缘式策略的进程也较快。丹参组大鼠在第2组次时已较梗死大鼠的反应时和行程明显缩短，表明丹参可以显著改善空间认知功能障碍。

HSP32能被包括热应激在内的各种刺激诱导表达^［9］。HSP32催化降解血红素生成胆色素和CO，胆色素具有抗氧化作用，当胆色素处于适宜浓度时，其发挥脑保护作用，而当胆色素浓度过高时，也会发挥神经毒性作用。在正常大鼠脑内HSP32表达微乎其微，很难检测到，本实验