摘要目的研究大鼠大脑中动脉缺血后环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的表达。方法采用栓线法制备大脑中动脉缺血模型,利用免疫组化方法检测COX-2表达情况。结果脑缺血区的周围大脑皮质及远隔的海马回区域有COX-2蛋白质表达。结论在COX-2表达的部位花生四烯酸代谢亢进。

Expression of cyclooxygenase-2 following ischemic middle cerebral artery in rat

Huang Haiyan,Luo Yinan,Liu Xinhua,et al

(Department of Neurosurgery,The First Teaching Hospital of Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021)

AbstractObjectiveMade ischemic models of middle cerebral artery in rat and expression of cyclooxygenase-2．MethodsThread technique was used to make ischemic models of middle cerebral artery and measure expression of cyclooxygenase-2 by immun ohistochemistry．ResultThere was expression of cyclooxygenase-2 in surroundings cortex of cerebral ischemia and remote hippocampus．Conclusionaccelerae metabolism of arachidonic acid can be in these regions.

Key wordsCyclooxygenase-2Arachidonic acidFocal cerebral ischemiaImmunohistochemistry

大鼠脑缺血后皮质、海马回等部位Ca²⁺大量进入细胞内，Ca²⁺激活磷脂酶A₂和C，导致膜磷脂水解，释放出大量花生四烯酸。后者被环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)降解后释放出TXA₂和产生自由基，这些物质均可加速缺血后细胞损伤^［1］。为此，我们探讨大鼠大脑中动脉缺血后COX-2蛋白质的表达，研究缺血后花生四烯酸的代谢变化。

1对象与方法

大鼠大脑中动脉缺血模型采用雄性SD大鼠,体重280～300g，由日本东北大学提供。在0.5%～2%氟烷、NO₂和O₂混合气体麻醉下，用加热处理头端呈圆形4-0尼龙手术线由颈外动脉经颈内动脉插至大脑前动脉(插入深度18～20mm)，制成大脑中动脉缺血模型^［2］。手术中用恒温水袋调节使直肠温度维持在37℃。持续缺血组：闭塞2、4、8、24h(每组各5只)。空白对照组除不插尼龙手术线外其余步骤同上。在各自的缺血时间内，深麻醉下用生理盐水和4%多聚甲醛灌流固定后，开颅取出脑组织，放入4%多聚甲醛溶液内保存，然后用振动切片机在纹状体和海马回水平制成100μm的脑组织切片，采用浮片法(free floating) 4℃下加一抗孵育12h。一抗用兔抗大鼠COX-2(IBL，Japan)，二抗用生物素化羊抗兔IgG,采用ABC法显色。

2结果

空白对照组无COX-2的表达。缺血2h组缺血区域以外的大脑皮质和双侧海马回可见COX-2阳性细胞表达，呈棕黄色。缺血4、8、24h呈持续阳性反应。采用高倍(100倍)观察。在大脑皮质免疫细胞为神经细胞，在海马回免疫细胞为颗粒细胞和锥体细胞，而在纹状体没有发现明显阳性表达(见图1、图2)。

A:空白对照;B:缺血2h;C:缺血4h;D:缺血8h;E:缺血24h;F:100倍

图1免疫组织化学染色皮层COX-2的表达

A:空白对照;B:缺血2h;C:缺血4h;D:缺血8h;E:缺血24h;F:100倍

图2免疫组织化学染色海马COX-2的表达

3讨论

关于脑缺血后COX-2的表达，Planas等^［3］采用60min一过性中动脉闭塞模型，利用原位杂交方法，报道了除大脑缺血区域外的皮层和海马回及纹状体等部位的COX-2 mRNA表达。而Collaco等^［4］利用中大脑动脉缺血模型，利用Northern blot法，证明了缺血区域的COX-2 mRNA的表达。Nogawa等^［5］利用RT-RCR法，证明了缺血半球的COX-2 mRNA的存在。Nogawa等报告了MCA缺血后2h在缺血区周围广泛大脑皮质的COX-2蛋白质表达。我们采用中动脉缺血模型，利用免疫组化法，对缺血后COX-2蛋白质变化加以研究，其结果与文献报道基本相符。

本实验主要研究缺血2、4、8、24h后大脑皮层、海马回和纹状体和COX-2蛋白质表达。缺血2h后，缺血区域以外的大脑皮层即有COX-2表达。并随缺血时间和延长免疫性逐渐增强，并向深层扩展。而缺血区大脑皮层和纹状体没有COX-2表达。缺血后，在缺血区由于神经细胞发生不可逆的变化，丧失了功能和形态，同时纹状体是不完全缺血区，随缺血时间延长，细胞丧失了功能和形态，从而丧失了COX-2表达能力。而在缺血区以外的大脑皮层，由于受从缺血区内释放出的花生四烯酸的刺激，使皮层处于反复去极化状态，神经兴奋由大脑皮层向海马回、齿状回扩散，并通过海马回传导至对侧，引起CA₃-CA₁神经兴奋，使上述区域COX-2表达。同时在海马回区，颗粒细胞层表现强阳性，而锥体细胞层仅在CA₃-CA₄呈弱阳性表达，与文献报告COX-2 mRNA表达部位不同^［6］，可能与检出方法的灵敏度有关，或者和前脑缺血后上述部位发生迟发性神经坏死有关，是我们今后研究的课题。

同时，在本研究中COX-2蛋白质的表达持续到缺血后24h，与文献报道相符合。Hsu等^［7］测定了MCA闭塞后的6-Keto-PGF_1α和TXB₂这些COX代谢产物的变化，其结果是缺血后上述产物有明显增高，持续至大脑中动脉缺血后72h,这也支持本实验的论证。

由于COX-2是花生四烯酸代谢所必需的酶，在COX-2表达的上述部位，提示花生四烯酸代谢亢进。其代谢产物前列环素和TXA₂等产生增加，可加重脑缺血后低灌流损伤。本实验观察了大脑中动脉缺血后不同时间缺血区及非缺血区COX-2蛋白表达的变化，提示非缺血区花生四烯酸代谢亢进，而花生四烯酸代谢亢进又促进了缺血性细胞损害。抑制COX-2蛋白表达是预防缺血性细胞损害及迟发性神经元坏死的关键。

参考文献

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(1999-01-21收稿1999-07-15修回)