摘要目的在尿激酶溶解大鼠脑血栓治疗中，研究亚低温对溶栓复流后大脑中动脉缺血区P⁵³蛋白表达的影响。方法应用肾血管性高血压大鼠(RHRSP)，用光化学法制成一侧大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，在血栓形成后0.5h应用尿激酶静脉溶栓复流后，用免疫组织化学的方法研究P⁵³蛋白的表达。结果亚低温组P⁵³蛋白的表达，明显弱于正常体温组。结论亚低温降低脑缺血区域的P⁵³蛋白的表达，可能是亚低温产生脑保护的机制之一。

To study the effects of mild hypothermia (MH) on expression of P⁵³ protein in ischemic brain of rat

Peng Fuhua,Su Zhenpei,Li Ling,et al

(Department of Neurology,The Third Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Science,Guangzhou 510630.)

AbstractObjetiveTo observe whether mild hypothermia (MH) affected the expression of P⁵³ protein in ischemic brain of rat.MethodsMiddle cerebral artery occlusion(MCAO) induced by photochemical method in renovascular hypertensive stroke-prone rats(RHRSP).At 0.5 hour after the thrombotic occlusion of MCAO,urokinase (UK) were administered intravenous infusion.The expression of P⁵³ protein was assessed by using immunohistochemical method.ResultThe expression of P⁵³ protein reduced in MH group.ConclusionMH may play a role in protection of ischemia neurons by reducing expression of P⁵³ protein.

Key wordsCerebral ischemiaThrombolysisMild hypothermiaP⁵³ protein

1材料与方法

1.1实验动物选用纯种健康雄性SD大鼠30只，体重90～120g，鼠龄2～3个月。大鼠均行双肾双夹肾动脉狭窄术^［1］，术前3d每日用尾筒法测量血压1次。MAO前，光化学MCAO制作及亚低温治疗过程中，用生理三仪器监测股动脉血压情况。

1.2RHRSP进行光化学法MCAO模型复制^［2］双肾动脉狭窄术后高血压持续8～10周以上，血压达24kPa或以上，从未出现脑卒中神经系统症状的RHRSP，用3%戊巴比妥钠35～40mg/kg腹腔麻醉，经左侧颞部入路，在颧弓与颞鳞骨接合处的前端2mm处用牙科钻作一直径为5mm的骨窗，透过硬脑膜，可清楚看到左侧MCA近段跨过嗅束处。经股静脉注射3%玫瑰红B(30mg/kg体重)后，用Nd-YAG激光器发出的激光(波长320nm，光斑直径3mm，功率0.3W)持续照射MCA主干近端及跨嗅束段10min。注射尿激酶后90min用手术显微镜观察MCA血管再通情况后，缝合切口。对照组大鼠开颅后，股静脉注射3%玫瑰红B，不用激光照射。

1.3亚低温实施方法在24℃环境中，大鼠麻醉后，取仰卧位固定，用冰袋覆盖其体表暴露部位，冰量按100g/100mg体重，诱导时间控制在10min，亚低温温度维持在32～34℃，维持时间为3h，自然复温。采用上海产WM-03型电子温度计，以直肠温度代表全身深部体温。

1.4正常体温和亚低温溶栓治疗的研究尿激酶用量为6万U/kg体重计算，MCAO术后从股静脉推注，用3ml生理盐水配制，先静脉快速推注1/3，其余15min推注完毕，正常体温组为MCAO后0.5h行溶栓治疗。亚低温组为MCAO后0.5h同时进行亚低温和溶栓治疗。正常体温组和亚低温组各12只大鼠。

1.5P⁵³蛋白的免疫组织化学方法和强度分析行P⁵³蛋白检查的正常体温对照组和亚低温组大鼠经历MCAO术后30min从股静脉注射尿激酶溶栓复流。应用ABC免疫组织化学方法。P⁵³抗体是来自基因公司的单克隆抗体(Pab240)，阻断血清及Ⅱ、Ⅲ抗体采用博士生物工程有限公司的试剂盒。

免疫组化染色强度结果分析采用Optimas 5.0,图像分析系统取高倍镜下选缺血侧皮层区5个典型视野，以阳性单位表示P⁵³表达强度^［3］。

1.6统计处理采用spss统计软件对数据进行处理，所有计量资料数据用±s表示，两样本均数比较采用t检验。

2结果

2.1RHRSP模型和光化学法MCAO模型30只SD大鼠用双肾双夹肾动脉狭窄术复制成RHRSP。术前血压为12.95±2.51kPa,术后7 d开始血压明显上升，平均19.43 ± 3.56kPa,术后3周25.84±3.63kPa。10周血压30.16±4.47kPa。在暴露MCA手术过程中，损伤出血死亡4只，其余26只成功复制成左侧MCA主干血栓形成模型。大鼠股静脉注射玫瑰红B后，在激光束下，通过滤光片，可以看到MCA呈桔红色，随着激光的照射，颜色呈黄色，MCA完全闭塞，颜色呈白色。溶栓复流后，用手术显微镜能观察到血管再通。正常体温组溶栓复流率58.33%(7/12)，亚低温组的溶栓复流率为75.00%(9/12)。

2.2病理组织学表现和P⁵³蛋白的表达对照组及无缺血的大脑半球未见变异型P⁵³蛋白的表达。通过HE染色，观察到溶栓复流后的脑梗塞灶比MCA未再通的小。溶栓复流后，HE染色见脑缺血灶有红色神经元、残骸神经元，周边可见黑色神经元。免疫组织化学染色发现P⁵³蛋白表达主要在缺血灶中心的死亡细胞，大脑皮层的P⁵³蛋白染色比基底节区深，在缺血灶周围形态完整的细胞P⁵³蛋白染色很弱。

2.3亚低温对缺血区P⁵³蛋白表达的影响溶栓复流的大鼠在MCAO后24h处死，选择相同部位大脑皮层的P⁵³蛋白表达强度作图象分析，正常体温组的阳性单位为46.73±7.78，亚低温组的阳性单位为38.62±8.37，亚低温组P⁵³蛋白的表达，明显弱于正常体温组的表达(P＜0.05)。

3讨论

脑缺血后神经细胞迟发性死亡参与梗塞灶形成，迟发性神经元死亡主要机制为细胞凋亡^［4］。目前研究发现，与细胞凋亡紧密相关的基因Bcl-2、P⁵³、ICE等都参与了迟发性神经元死亡的发生^［5］。P⁵³基因有野生型(wt-P⁵³)和突变型(m-P⁵³)，正常细胞中存在wt-P⁵³及其蛋白，可通过抑制细胞增殖或激活其它基因抑制细胞增殖循环，从而使损伤细胞在分裂前有足够的时间修复。在外界一些因素作用下，wt-P⁵³发生突变，m-P⁵³对细胞无保护作用^［6］。Crumrine等^［7］利用转基因技术，观察P⁵³基因对脑缺血后梗塞灶大小的影响，发现使用带有无效的P⁵³基因的转基因鼠，在MCA结扎后，其梗塞面积比带有野生型P⁵³基因鼠降低15%，发现降低P⁵³基因表达，脑缺血后神经元死亡数目减少。在细胞凋亡过程中，P⁵³基因是一种致死基因，诱导细胞凋亡，P⁵³蛋白被认为是导致细胞凋亡机制中的主要因子，脑缺血能诱导P⁵³基因的表达^［4，8］。P⁵³基因不仅参与了死亡性损伤，而且其作用可能与启动程序性死亡有关^［5］。亚低温已证实不仅能抑制急性缺血细胞的坏死，而且能减少以细胞凋亡为主要机制的缺血后迟发性细胞损害。

我们采用免疫组化的方法，对光化学诱导MCAO溶栓复流后，研究亚低温组和正常体温组脑缺血区域变异性P⁵³蛋白的表达，结果表明，在非缺血侧大脑半球未见P⁵³蛋白的表达,而缺血侧大脑半球正常体温组P⁵³蛋白表达明显强于亚低温组，说明亚低温能降低P⁵³的表达。亚低温降低P⁵³蛋白表达的机制不清楚，结合文献，可能与以下因素有关：(1)现在已有报道^［9］，亚低温能影响早期反应基因表达，因此，亚低温也可能直接影响P⁵³基因的表达，从而达到P⁵³蛋白表达降低。(2)脑缺血后和再灌注能诱导P⁵³基因的表达^［4，8］。而亚低温能减少缺血和再灌注后有害物质释放，因此，亚低温可能减弱P⁵³基因的表达。(3)亚低温减少Ca²⁺内流，调节调钙蛋白激酶活性，因而亚低温可能影响P⁵³蛋白的合成过程。迟发性神经元死亡的主要机制是细胞调亡。在细胞凋亡中，P⁵³是一种死亡基因，诱导细胞凋亡的发生，导致神经元迟发性死亡。我们实验结果表明，亚低温组的P⁵³蛋白表达低于正常体温组，提示亚低温可能通过降低突变型P⁵³蛋白来减少神经细胞死亡。

参考文献

1 黄如训，曾进胜，苏镇培，等.易卒中型肾血管性高血压大鼠模型.中国神经精神疾病杂志，1991，17(5)：257.

2 Brant D,Watson W,Dalton D,et al.Argon laser induced arterial photothrombosis.J Neursurg,1987,66:748.

3 申洪.免疫组织化学染色定量方法研究(Ⅲ).中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4(1)：89.

4 Li Y,Chopp M,Powers C,et al.Apotosis an