摘要目的研究神经生长因子(NGF)在缺血性脑损伤中对神经细胞凋亡的影响。方法采用大鼠4血管闭塞脑缺血模型，TUNEL方法原位标记DNA片段，观察脑室内注射NGF后海马CA₁区神经细胞凋亡的变化。结果使用NGF后3d海马CA₁区TUNEL阳性神经细胞数为神经细胞总数的13.9%±11.6%，与缺血对照组(21.3%±13.7%)比较显著减少(P＜0.01)。结论外源性NGF对脑缺血所致的神经细胞凋亡可能具有一定的保护作用。

Effect of nerve growth factor on neuronal apoptosis in hippocapal CA₁ sector after global ischemia in rats

Zhang Junjian,Ruan Xuzhong，Wang Yingzhou,et al.

(Department of Neurology,Tongji Hospital,Wuhan,430030)

AbstractObjectiveTo investigate the protective action of nerve growth factor (NGF) on neuronal apoptosis by ischemic insults.MethodsGlobal ischemia in Wistar rats was induced using four-vessel occlusion,and NFG group intraventricular adminstration of NGF after ischemia,control group received the same volue of solvent.At the 3 days after ischmia,terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotion nick endlabeling (TUNEL) hippocampal CA₁ sector.ResultThe results showed that the number of TUNEL positive cells to the number of whole cells in the CA₁ subified was 21.3±13.7% in NGF group,and 13.9%±11.6% in control group,significant difference between the ratios in two group (P＜0.01).ConclusionIt was suggested that intraventricular NGF has a protective effect on neuronal appoptosis by ischemic insults.

Key wordsCerebral ischemiaNerve grouth factorApoptosisHisppocampus

近年来的一些研究显示细胞凋亡是脑缺血神经细胞损伤中与细胞坏死不同的一种形式，许多细胞因子对神经细胞凋亡起调控作用，且其中神经生长因子 (NGF)与神经细胞凋亡的关系十分密切，体外实验NGF缺乏可诱导神经细胞凋亡^［1］。但是，NGF对脑缺血所致的神经细胞凋亡是否有抑制作用目前尚未见报道。我们采用大鼠全脑缺血模型，TUNEL法原位标记DNA片段，观察NGF对海马CA₁区神经细胞的影响，现报道如下。

1材料和方法

1.1动物模型雄性Wistar大鼠12只，体重270～300g(本校实验动物中心提供)全脑缺血模型的制备采用4VO法。10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉下，在第一颈椎横突孔处烧灼双侧椎动脉使其闭塞。次日夹闭双侧颈总动脉10min，然后去夹让其血流再通。

1.2实验分组和给药方法随机将动物分为缺血对照组和缺血给药组，每组6只大鼠。缺血给药组在双侧椎动脉闭塞后，脑立体定位仪上，用微量注射器将10单位NGF(军事医学科学院提供) 缓慢注入右侧侧脑室 ( 前囟后 0.8mm，正缝旁1.5mm，进针深3.7mm)。缺血给药组用等量林格氏液注入右侧侧脑室。

1.3组织切片制备及组织病理大鼠4VO后3d再次麻醉，经升主动脉插管，肝素生理盐水100ml冲洗，4%多聚甲醛酸盐缓冲液(4℃，pH7.4)灌注约400ml，取脑浸入上述固定液中，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石醋包埋，冠状连续切片，切片厚度6μm。常规HE染色，在普通光镜下观察组织病理学变化，20×10倍下计数海马CA₁区锥体细胞总数。

1.4原位标记DNA片段取与HE染色相邻的切片用TUNEL(terminal deoxycleotidyl-transferase-mediated dUTP-biotin nick endlabeling)法^［3］原位标记凋亡细胞的DNA片段。由美国Oncor公司提供Apop Tag^TM荧光检测试剂盒，具体操作程序按说明书进行，在荧光显微镜下观察，20×10倍下计数海马CA₁区内TUNEL阳性细胞数。

1.5统计方法分别以两相邻切片上海马CA₁区TUNEL阳性细胞数与HE染色片上锥体细胞总数的百分比比较两组凋亡细胞的差异，用χ²检验进行判定。

2结果

普通光镜下观察缺血对照组海马CA₁区锥体细胞浓染、皱缩和肿胀等细胞损伤性改变较缺血用药组广泛，但两组锥体细胞总数比较无显著性差异(P＞0.05)，TUNEL标记阳性细胞呈现微黄色荧光，胞浆不着色，阴性对照片上未呈现荧光。海马CA₁区TUNEL阳性细胞占细胞总数的百分比：缺血对照组21.3%±13.7%，缺血用药组为13.9%±11.6%，两组比较有显著性差异(P＜0.01)。

3讨论

NGF是一种多亚基蛋白组成的靶组织源性细胞因子，对神经组织的生存、发育、修复及神经功能的维护具有重要的作用。NGF和NGF mRNA在脑内主要分布在海马和皮层，而NGF mRNA迅速增加，而对缺血十分敏感的海马CA₁区却不增加，Shigeno等^［4］也曾报道沙土鼠大脑中动脉闭塞后海马CA₁区的NGF含量减少及该区存在的迟发性神经细胞死亡，在侧脑室注射NGF后迟发性神经细胞死亡明显减轻。最近一些研究提示迟发性神经细胞死亡与神经细胞凋亡有关^［5］。因此，我们推测NGF对神经细胞凋亡可能具有抑制作用。本研究结果显示，脑室内注射NGF后可使脑缺血海马CA₁区神经细胞凋亡明显减轻，支持上述推测，表明NGF通过抑制神经细胞凋亡而对缺血性脑损伤具有一定的保护作用。

外源性NGF对脑缺血后神经细胞凋亡的调控机制目前尚不清楚，Tanaka等^［6］研究提示NGF可能通过抑制神经细胞骨架蛋白变性和/或促进其再生而发挥作用。Chalfe等^［7］提出神经生长因子缺乏时细胞合成了一种杀伤蛋白(killer protein)启动了细胞死亡程序。应用NGF可抑制这种蛋白的合成，从而防止神经细胞的死亡。但无论何种途径，NGF的抗调亡作用最终可能是通过激活某些功能蛋白的基因而实现的，其确切机理的阐明有待研究的进一步深入。

参考文献

1 Zhang L,Sarafian T,Kane D,et al.bal-z inhibits death of central neural cells induced by multiple agents.Droc Natl Acad USA,1993,90:4533.

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3 Gavrieli Y,Sherman Y,Ben/Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmention.J Cell Biol,1992,119:493.

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5 Nitatori T,Sato N,Waguri S,et al.Delayed neuronal death in the CA₁ pyramidal cell layer of the gerbil hippocampus following transient ischemia is apoptosis.J Neurochir,1995,15:1001.

6 Tanaka K,Tsukahara T,Hashimoto N,et al.Effect of nerve growth factor on delayed neuronal death after cerebral ischemia.Acta Neurochir,1994,129:64.

7 Chalfe M,Wolinsky E.The identification and suppression of inherted neurodegeneration in caenorhabdities elegans.Nature,1990,345:410.

(1998-03-02收稿1999-07-04修回)