摘要目的评价不同损毁程度C57BL小鼠帕金森病(PD)模型纹状体多巴胺转运蛋白(DAT)的变化。方法根据腹腔注射MPTP的天数将小鼠分为1、3、5和7d模型组以及对照组，静脉注射^99mTc-TRODAT-16mCi，1h后处死行脑纹状体放射自显影，同时行免疫组化酪氨酸羟化酶(TH)染色。结果对照组的放射自显影可见^99mTc-TRODAT-1于纹状体部位有高度放射性聚集，且两侧纹状体基本相同。注射MPTP 1d者，其纹状体的放射性浓集比对照组有所下降。注射MPTP 3、5及7d者，两侧纹状体的放射性浓集逐日降低，第7d者几乎消失。TH染色发现黑质TH阳性神经元亦随注射MPTP天数的增加而数量减少。结论不同程度损毁的C57BL小鼠PD模型可模拟PD的发展过程，^99mTc-TRODAT-1作为DAT的显影剂可用于早期诊断的神经显像学研究。

Autoradiographic study on dopamine transporter in C57BL mouse models of Parkinsonism with ^99mTc-TRODAT-1

Liu Zhenguo，Cheng Shengdi,Fang Ping,et al.

(Department of Neurology,Ruijin Hospital,Clinic and Research Center for Parkinson's Disease,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025)

AbstractObjectiveTo evaluate the density change of dopamine transporter(DAT)in striatum of C57BL mouse model of Parkinsonism.MethodsIn this study,MPTP and Tc-TRODAT-1 were injected intravenously to mice respectly in several groups.Autoradiography and histoimmunochemical stain technology were used respectly.ResultAt 1h postinjection of ^99mTc-TRODAT-1,exvivo autoradiography indicated that the striatum displayed the intense radioactivity in the control group.In group of MPTP lesion for 1 day,the radioactivity of the striatum was reduced compared with that of control group.In groups of 3,5 and 7 days,the radioactivity of the striatum was decreased,and the degree of decrement was related positive to the days of MPTP lesion,and in group of 7 days,the radioactivity in striatium almost disappeared.The loss of TH positive cells and fibres in substantia nigra and striatum of models were found,and the degree of loss was also related positive to the days with MPTP lesion.ConclusionThe progressive degeneration of Parkinson^,s disease was mimicked by C57BL mouse model of parkinsonism with the different degree of MPTP lesioned substantia nigra.^99mTc-TRODAT-1 as a imaging ligand for DAT may be useful for the early diagnosis of PD.

Key wordsDopamine transporterParkinson^，s diseaseC57BL mouseAutoradiography

近年来，国外有关多巴胺转运蛋白(Dopamine transporter，DAT)配体显像研究报道较多，尤其在帕金森病(PD)的单光子发射断层扫描(SPECT)活体显像观察DAT功能状态方面进展迅速，国内尚未见研究报道。近期研制出一种可卡因衍生物［2β-N，N^，-双(2-硫乙基)乙撑二胺基，3β-(4-氯苯基)托烷］(TRODAT-1)，可用^99mTc标记^［1］，既稳定又经济，适合于临床应用，本实验采用放射自显影法观察自行合成并标记的^99mTc-TRODAT-1在不同黑质损毁程度PD小鼠模型的纹状体突触前膜DAT功能改变，为^99mTC-TRODAT-1用于PD的早期诊断研究奠定基础。

1材料与方法

1.1PD小鼠模型制备取C57BL小鼠30只，体重平均25g，雄性。随机分成5组，每组各6只，第1～4组均腹腔注射甲基-苯基-四氢吡啶(MPTP)30mg/kg，依次分别为注射1、3、5和7d；第5组为对照组，腹腔注射相同体积的生理盐水连续7d。

1.2^99mTc-TRODAT-1制备及标记参照Meegalla等^［1］方法，以可卡因为原料，经多步反应合成配体TRODAT-1。取配体200μg(0.1ml乙醇溶液)加0.1ml 2mol/L的HCL、320μg葡庚糖酸钠盐、50μl 0.05mmol/L EDTA,调pH至5～6，加0.5～4ml ^99mTcO₄^-溶液，100℃加热30min，冷却即用。采用高效液相(HPLC)检测，标记率及放化纯度均大于90%。

1.3模型动物放射自显影于模型制备后第12d，各组取3只动物，尾静脉注射^99mTc-TRODAT-1 6mCi，1h后断颈取脑，冠状位冰冻切片，片厚18μm。各组选取经纹状体部位、形态相同的组织切片3～4张，贴在清洁的X光片上。冷风吹干后，将其紧贴于G-250自显像仪扫屏，显像曝光2h，再用图像分析系统对每组大鼠两侧纹状体及额叶感兴趣区(ROI)(0.41mm²)进行光灰度测定，取每组的平均值，并计算每组动物纹状体/皮层比值，这一比值与脑纹状体的放射性计数呈良好的相关性。每组动物纹状体/皮层比值的不同亦代表其DAT密度的不同，间接反映出纹状体DA能神经纤维及黑质DA能神经元数量的变化。

1.4黑质及纹状体免疫组化染色每组动物各取1只，经左心室内4%多聚甲醛灌注后处死取脑，分别于纹状体及黑质部位冠状冰冻切片，片厚20μm，进行免疫组化ABC法酪氨酸羟化酶(TH)染色。

2结果

2.1模型动物的行为变化每次腹腔注射MPTP(30mg/kg)后，C57BL小鼠均出现全身震颤、皮毛及尾巴竖立，活动减少，均持续30min后震颤消失，但活动减少仍存在。注射天数增加其活动减少程度亦加重。于第1、2次注射后体重平均下降1g,从第三次开始体重变化不大。对照组则活动如常，体重亦无变化。

2.2动物脑组织放射自显影观察对照组小鼠纹状体区冠状位图像可见纹状体部分有放射性浓集，左右侧灰度相同；注射MPTP1d者，其纹状体部位的放射性浓集仍可见到，其灰度比对照组纹状体有所降低；注射MPTP3d者，其纹状体的放射性浓集较对照组降低，其灰度亦较对照组降低；MPTP 5d者，其放射性浓集减少更加明显，灰度降低亦很明显；MPTP7d者，其放射性浓集几乎消失，其灰度降至皮层的灰度水平(图1)。经对两侧纹状体及额叶皮层ROI灰度的测定，各组动物的纹状体/皮层值为：对照组2.46±0.17；MPTP 1d者2.20±0.11；MPTP 3d者1.79±0.18；MPTP 5d者1.59±0.20；MPTP 7d者1.39±0.09。MPTP 1、3、5和7d组较对照组均存在显著性差异，且随MPTP注射天数增加，放射性计数呈显著性减少。

图1MPTP处理后不同时间C57BL小鼠脑^99mTc-TRODAT-1放射自显影片。

2.3TH免疫组化观察对照组小鼠黑质致密带以及网状带内可见密集的TH阳性细胞呈棕褐色，顶盖背区(VTA)亦可见到TH阳性细胞，纹状体部位可见密集的TH阳性纤维；注射MPTP 1d者，其黑质致密带、网状带的TH阳性细胞以及(VTA)区的TH阳性细胞未见明显减少，纹状体TH阳性纤维亦很丰富；注射MPTP 3d以及5d者，其黑质致密带和网状带TH阳性细胞明显减少，约为对照组的10%～15%。而VTA区的TH阳性细胞变化不大，纹状体部位可见细而稀疏的TH阳性纤维；注射MPTP 7d者，其黑质TH阳性细胞几乎消失，VTA区TH阳性细胞亦轻度减少，纹状体TH阳性纤维明显减少。

3讨论

帕金森病(PD)病理基础是中脑黑质多巴胺(DA)能神经元及黑质纹状体通路变性死亡，致纹状体部位DA含量降低，DA能神经元突触前膜DAT密度或功能下降、突触后膜DA受体超敏，但前者比后者更直接、更敏感。尸检表明PD病人纹状体(尾核和壳核)DAT功能下降^［2］。DAT功能或密度的改变与DA能神经元数量的变化相一致^［3］。黑质DA能神经元数量可以通过DAT显像进行定量检测，为临床PD辅助诊断指标的确立提供了一种手段。

近年来对DAT的配体研究很多，其配体多为可卡因衍生物，如β-CIT、FP-CIT、IPT等。采用DAT配体正电子断层扫描(PET)或单光子断层扫描(SPECT)研究DAT功能或分布亦有报道，尤其是在PD方面是新近研究的热点^［3，4］。目前临床上作为诊断性放射物的标记核素多为锝(Tc)标记，其半衰期6h，且能量为140Kev，均为γ射线，适合临床应用。TRODAT-1是新近合成的一种托烷衍生物，其特性与β-CIT、FP-CIT、IPT等相类似，均为DAT配体，但TRODAT-1可以用^99mTc进行标记，有可能广泛应用于临床如PD等涉及DAT功能变化疾病的诊断和疗效观察。

MPTP是哌替啶类衍生物中的一种副产品，具有选择性损害黑质DA能神经元的特性。在猴应用MPTP后，其行为、病理、生化方面的改变十分类似于人类PD的特征。C57BL小鼠是一种特殊品系的褐色小鼠，其对MPTP很敏感，本实验采用MPTP30mg/kg于C57BL小鼠腹腔注射，并根据注射的天数的不同(1，3，5，7d)进行分组，使每组小鼠受MPTP损毁的程度逐渐加重，模拟临床PD的病程，同时采用1d以及3d的损毁模拟PD早期的变化。在此基础上观察各组动物纹状体DAT的变化，发现注射MPTP 1d者的DAT比对照组已有减少，注射MPTP 3d者与对照组相比DAT已