摘要目的应用钙载体和PC₁₂细胞株探讨胞浆钙离子与神经细胞凋亡之间的关系。方法水母发光蛋白导入法测量PC₁₂胞浆钙离子，细胞存活率监测细胞死亡，DNA琼脂糖电泳证实细胞凋亡。结果钙载体(A₂₃₁₈₇)升高PC₁₂胞浆钙离子，降低细胞存活率，DNA琼脂糖电泳显示典型的DNA梯形带。结论胞浆钙离子升高激活内源性核酸内切酶，导致DNA核小体间断裂，启动神经细胞凋亡。

Neuronal apoptosis and cytoplasmic calcium

Han Enji,Han Shuying.

Department of Neurology,

Shandong Medical University,Jinan 250012

AbstractObjectiveRelationship between neuronal apoptosis and changes in cytoplasmic calcium was studied using A₂₃₁₈₇,calcium ionophore,and PC₁₂ cell line.MethodsChanges in cytoplasmic calcium was measured with aequorinloaded method, neuronal death was shown in cell viability,DNA fragmentation was used as an apoptosis indicator.ResultsA₂₃₁₈₇ caused an increase in cytoplasmic calcium,loss of cell viability,and DNA fragmentation in PC₁₂ cell line.ConclusionIncrease in cytoplasmic calcium activates endonuclease(s) which causes DNA fragmentation at internucleosomal sites and neuronal apoptosis.

Key wordsCytoplasmic calciumApoptosisEndonuclease

细胞凋亡是生物发育和衰老的重要机制之一。中枢神经系统发育过程中，过多的神经细胞死亡被证实为细胞凋亡^［1］。本文应用钙载体(A₂₃₁₈₇)和细胞株PC₁₂研究了胞浆钙离子和神经细胞凋亡的关系。

1材料与方法

1.1材料

A₂₃₁₈₇购自德国Boehringer Mannheim公司，PC₁₂细胞株购自美国ATCC公司。其余材料和设备皆由美国Henry Ford医院分子神经病学实验室提供。

1.2方法

1.2.1细胞培养常规培养细胞株PC₁₂，培养液由85%RPMI、10%马血清和5%胎牛血清组成。当80%的细胞互相接触时，改用含有神经生长因子(NGF，100μg/L)的培养液培养7d，PC₁₂生长出神经突，分化的PC₁₂代表交感神经细胞。

1.2.2细胞存活率^［2］实验前24h把分化的PC₁₂制成细胞悬液(细胞数1×10⁹／L)，接种到35mm×10mm的培养皿(0.5ml/皿)。常规培养24h，然后加入不同浓度的A₂₃₁₈₇ 再培养24h，应用锥虫兰法分别计数死细胞和活细胞，然后计算出细胞存活率，公式=［活细胞÷(活细胞+死细胞)×100%］。

1.2.3胞浆钙离子测定^［3，4］分化的PC₁₂经过低渗处理后，导入水母发光蛋白，水母发光蛋白与钙离子结合发出蓝光，用血小板胞浆钙离子测定仪(Chrono-Log，Haverston,PA)测量并计算出胞浆钙离子浓度。本文把导入水母发光蛋白的细胞分为实验组和对照组，每份标本1ml含细胞1.0×10⁶。测量胞浆钙离子时，实验组分别加入各种浓度的A₂₃₁₈₇ 10μl,使A₂₃₁₈₇ 的最终浓度分别为0.3μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L;对照组加入生理盐水10μl。

1.2.4DNA凝胶电泳^［5］实验前24h把分化的PC₁₂制成细胞悬液(细胞数1×10⁹/L)，接种到100mm×20mm的培养皿(2ml/皿)，常规培养24h，然后加入A₂₃₁₈₇(100μmol/L）分别培养1h和6h。经过A₂₃₁₈₇培养过的PC₁₂，用细胞裂解液消化细胞，常规提取DNA，置于含溴化乙淀的1.5%琼脂糖凝胶中电泳。细胞凋亡时，电泳出现典型的DNA梯形带。

2结果

2.1A₂₃₁₈₇升高PC₁₂胞浆钙离子对照组胞浆钙离子浓度为1.45±0.12μg/L(x±s，n=6);实验组A₂₃₁₈₇浓度分别为0.3μg/L、0.5μg/L 、 1.0μg/L , 对应的胞浆钙离子为 5.71 ± 0.24μg/L、7.50±0.35μg/L、8.65±0.47μg/L(x±s，n=6)

2.2A₂₃₁₈₇降低PC₁₂细胞存活率对照组细胞存活率为91%±4%(x±s，n=6);实验组A₂₃₁₈₇浓度分别为0.1μg/L、1.0μg/L、10μg/L,对应的细胞存活率为71%±8%、48%±6%、24%±5%(x±s，n=6)。

2.3A₂₃₁₈₇诱导PC₁₂凋亡DNA琼脂糖凝胶电泳出现典型的DNA梯形带。

3讨论

本文应用发光蛋白导入法证实了A₂₃₁₈₇引起PC₁₂胞浆钙离子升高，以细胞存活率为指标显示了A₂₃₁₈₇引导细胞死亡，并且通过DNA凝胶电泳进一步揭示了A₂₃₁₈₇诱导的细胞死亡属凋亡。DNA在核小体间断裂，分裂成特异性片断是细胞凋亡的标志^［6］，应用琼脂糖凝胶电泳分析DNA片断，DNA出现多条带组成的梯形，梯形的底是一个大约180～200碱基对组成的DNA片断。现代研究证实DNA在核小体之间断裂是内源性核酸内切酶被激活的结果^［5］。内源性核酸内切酶是一种钙离子依赖性内切酶。为了评价钙离子在神经细胞凋亡中的作用，Catmann等利用Fura-2成像技术观察了淀粉样变性蛋白(β-AP)诱导神经细胞变性过程^［7］，神经细胞变性前首先是胞浆钙离子升高。我们的研究又一次证实了胞浆钙离子升高是神经细胞凋亡的启动因素 。 A₂₃₁₈₇作为一种钙载体 ， 它特殊的生物学功能是能开通细胞膜钙离子通道^［8］，A₂₃₁₈₇与细胞接触后立即引起胞浆钙离子升高，随着细胞与A₂₃₁₈₇接触时间延长，DNA特异性断裂逐渐增多。由于DNA特异性断裂是核酸内切酶激活的标志，这一结果又一次证实了胞浆钙离子升高—激活内源性核酸内切酶—DNA在核小体间断裂—神经细胞凋亡的过程。

几十年前科学家就发现胚胎发育过程中，有些不需要的细胞发生“自然”死亡。直到1972年Kerr等描述了这一过程的超微结构变化并命名为细胞凋亡，掀起了对细胞凋亡的研究热潮。现在证实这种细胞“自杀”不仅在细胞发育过程中起着关键作用，而且象新陈代谢一样，整个生命过程都在不间断的进行。正常情况下，机体借助这一机制维持器官的形状，完成组织的退化，消灭各种受伤的、老化的和突变的细胞。这一过程一旦失控就会发生疾病。目前发现细胞凋亡与肿瘤、自身免疫性疾病及中枢神经系统变性疾病有密切关系。虽然细胞凋亡的确切机制还不清楚，但是钙离子启动细胞凋亡的理论将为防治这些疾病带来希望，各种钙离子通道抑制剂降低细胞内钙离子浓度，抑制细胞凋亡已为这种防治方法迈出了可喜的一步。

本文为世界卫生组织(WHO)国际神经科学研究基金资助项目(1 F05 TWO4634-01)

参考文献

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(1999-01-08收稿)